呂雪蓮，于申業(yè)，倪宏波，衣 菲,2，田秋豐,2，劉思國

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學 動物科技學院，黑龍江 大慶 163319；2.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/動物細菌病研究室，黑龍江 哈爾濱 150001)

腸炎沙門菌(Salmonella enterica)是引起人類食源性疾病的主要革蘭陰性菌之一，并可以導致禽類、家畜等哺乳動物產(chǎn)生不同的疾病。沙門菌的致病力與其毒力基因密切相關，SPI-1 和SPI-2 是沙門菌的兩個重要毒力島，其中SPI-1 主要編碼Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)通過宿主的細胞膜轉(zhuǎn)運腸炎血清蛋白，此外，研究表明SPI-1 能夠侵染細胞誘導巨噬細胞產(chǎn)生細胞毒性[1-2]。SPI-1 編碼序列約為40 kb，具有一定的穩(wěn)定性，在自然分離株中極少存在SPI-1 部分或全部缺失的情況[3]。Red 重組是革蘭陰性菌最常用的反向遺傳操作系統(tǒng)，常規(guī)的方法是利用λ 噬菌體Red 重組酶將導入細胞的線性DNA 片段與染色體(或載體)的特定靶序列進行同源重組[4]。本研究室前期基于I-SceI 酶切原理對Red 同源重組系統(tǒng)進行改進，提高了重組效率、縮短了實驗周期。本實驗利用改進的系統(tǒng)對S.enterica 毒力島SPI-1 進行一步法敲除，為其生物學特性的研究提供了依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株及質(zhì)粒 S.enterica SM6、E.coil DH5α、Red 重組系統(tǒng)工具質(zhì)粒pKD3、pCP20 及pET-28a 均由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所細菌室保存；溫敏復制型質(zhì)粒pKD46a(基于pKD46 質(zhì)粒骨架，經(jīng)L-阿拉伯糖誘導后可產(chǎn)生Exo、Gam 和Bet 3 種同源重組酶以及I-SceI 酶)由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所細菌室構(gòu)建。

1.2 主要試劑 L-阿拉伯糖購自Sigma 公司；PCR試劑購自TaKaRa 公司；限制性內(nèi)切酶、T4 連接酶購自MBI 公司；DNA 膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 引物設計及合成 根據(jù)GenBank 中登錄的沙門菌毒力島SPI-1 基因序列(FJ496648.1)設計引物S1/S2 擴增上游同源臂、S3/S4 擴增下游同源臂。氯霉素抗性基因片段的擴增引物為C1/C2，質(zhì)粒pKD46a 的鑒定引物為P1/P2，毒力島SPI-1 敲除后的鑒定引物為D1/D2(表1)，引物由博仕生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 S.enterica感受態(tài)細胞的制備 將S.enterica 在LB 液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，按1∶100 轉(zhuǎn)接到100 mL LB 培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD600nm約為0.4 時，冰浴預冷10 min～30 min。先后以預冷的無菌水和10 %甘油各離心洗滌2 次，將菌體懸浮于600 μL 10 %甘油中，分裝后-80 ℃凍存。

表1 PCR 引物序列Table 1 Primers used in this study

1.5 打靶質(zhì)粒的構(gòu)建 以質(zhì)粒pKD3 為模板，擴增氯霉素抗性片段；以SM6 為模板，擴增毒力島SPI-1 上游和下游同源臂，PCR 產(chǎn)物純化經(jīng)相應酶切后膠回收。氯霉素抗性片段與載體pET-28a 連接，轉(zhuǎn)化到E.coil DH5α 中，PCR 與測序鑒定正確后，分別在氯霉素抗性片段的上下游連接SPI-1 上下游同源臂，重組質(zhì)粒命名為pET-SPI-1FCmR。

1.6 電轉(zhuǎn)化以及Red重組系統(tǒng)的誘導 取質(zhì)粒pKD46a 和pET-SPI-1FCmR 各1.5 μL 加入S.enterica感受態(tài)細胞中混勻，冰浴10 min，進行電轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化菌涂布于含氨芐青霉素(100 μg/mL)、卡那霉素(50 μg/mL)和氯霉素(30 μg/mL)的LB 平板上，30 ℃培養(yǎng)24 h。挑取單菌落進行PCR 鑒定，獲得共轉(zhuǎn)化重組菌。

將菌液轉(zhuǎn)接于含有氨芐和氯霉素的LB 培養(yǎng)基中，30 ℃220 r/min 培養(yǎng)至OD600nm約為0.3，加入L-阿拉伯糖至終濃度30 mmol/L，30 ℃180 r/min 誘導1 h，30 ℃靜置培養(yǎng)7 h～11 h，涂布含有氨芐青霉素和氯霉素的LB 平板，30 ℃靜置培養(yǎng)12 h 后挑取單克隆進行PCR 鑒定。陽性菌株命名為SM6ΔSPI-1::cat。

1.7 氯霉素抗性基因的敲除 按1.4 方法制備SM6ΔSPI-1::cat 感受態(tài)細胞，將pCP20 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入其中，涂布于含氨芐青霉素的LB 平板，30 ℃靜置培養(yǎng)24 h，挑菌鑒定正確后，轉(zhuǎn)接到無抗性的LB 培養(yǎng)基中，42 ℃220 r/min 誘導15 h～16 h 使FLP 重組酶表達。生長的菌落分別點到含氨芐青霉素的平板和氯霉素的平板上，兩個平板對應的位置均不長菌，利用鑒定引物D1/D2 進行PCR 鑒定，正確后的菌株命名為SM6ΔSPI-1。

1.8 體外遺傳穩(wěn)定性的檢測 挑取單個菌落接種于LB 培養(yǎng)基中，37 ℃220 r/min 培養(yǎng)至對數(shù)期，按1∶100 轉(zhuǎn)接到新鮮的LB 培養(yǎng)基中，連續(xù)傳代，取第5、10、15、20、25 及30 代菌液利用鑒定引物進行PCR 鑒定，檢測缺失菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.9 生長速率的比較 為對比缺失株SM6ΔSPI-1與野生株SM6 的生長狀態(tài)有無差異，分別挑取二者的單菌落接種于LB 培養(yǎng)基中，37 ℃220 r/min 過夜培養(yǎng)，將其按1∶100 比例分別轉(zhuǎn)接到5 mL LB 培養(yǎng)基中，調(diào)整初使菌液濃度(OD600nm約為0.05)，37 ℃220 r/min 培養(yǎng)，每隔1 h 取200 μL 菌液測定OD600nm值，直至細菌生長處于穩(wěn)定期，重復試驗3 次，繪制SM6ΔSPI-1 和SM6 的生長曲線。

1.10 統(tǒng)計分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0 軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 缺失株SM6ΔSPI-1的構(gòu)建與鑒定

2.1.1 打靶質(zhì)粒pET-SPI-1FCmR 的構(gòu)建 將氯霉素抗性片段、SPI-1 上游和下游同源臂分別連入pET-28a 載體構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-SPI-1FCmR，并以T7/T7ter 為引物鑒定重組質(zhì)粒，結(jié)果顯示，PCR 產(chǎn)物約2 500 bp(圖1)，測序結(jié)果與預期2 478 bp 一致。

圖1 重組質(zhì)粒pET-SPI-1FCmR 的PCR 鑒定Fig.1 PCR product identified recombinant plasmid of pET-SPI-1FCmR

2.1.2 質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)化 將pET-SPI-1FCmR 和質(zhì)粒pKD46a 共轉(zhuǎn)入S.enterica 感受態(tài)細胞中，以引物P1/P2 進行PCR 鑒定，結(jié)果顯示擴增產(chǎn)物約500 bp，與預期相符(圖2)。

2.1.3 氯霉素抗性基因的敲除與PCR 鑒定 將pCP20 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入陽性菌株中，熱誘導消除氯霉素抗性基因，構(gòu)建缺失菌SM6ΔSPI-1，以SM6ΔSPI-1 和SM6ΔSPI-1::cat 為模板，利用引物D1/D2 和T7/T7ter進行PCR 鑒定，結(jié)果顯示擴增產(chǎn)物分別約為1 500 bp和2 500 bp，大小與預期相符，表明氯霉素基因已經(jīng)從SM6ΔSPI-1::cat 中敲除，野生株SM6 毒力島SPI-1 基因序列約為40 kb，片段過長，因此PCR 擴增結(jié)果為陰性(圖3)。

圖2 pKD46a 轉(zhuǎn)化到Salmonella 的PCR 鑒定Fig.2 Identification of the plasmid pKD46a in transformed Salmonella by PCR

圖3 缺失株SM6ΔSPI-1 的PCR 鑒定Fig.3 Identification of the SM6ΔSPI-1 by PCR

2.2 S.enterica毒力島SPI-1缺失株的體外遺傳穩(wěn)定性 對S.enterica 缺失株進行體外連續(xù)傳代，取第5、10、15、20、25、30 代單菌落利用引物D1/D2進行PCR 鑒定，結(jié)果顯示未發(fā)生回復突變，表明缺失菌株能夠在體外穩(wěn)定遺傳(圖4)。

2.3 SM6與SM6ΔSPI-1生長速率的比較 在相同條件下培養(yǎng)SM6 和SM6ΔSPI-1，并且每間隔1 h測一次OD600nm值，繪制生長速率曲線。結(jié)果顯示SM6ΔSPI-1 在體外正常生長并且SM6ΔSPI-1 生長速率高于SM6，SM6ΔSPI-1 與SM6 在6 h～9 h 生長速率相比差異顯著(p<0.05)(圖5)。

圖4 SM6ΔSPI-1 遺傳穩(wěn)定性PCR 鑒定結(jié)果Fig.4 Stability test of the SM6ΔSPI-1 by PCR

圖5 缺失菌株與野生菌株生長速率的比較Fig.5 Growth rate of mutant strain SM6ΔSPI-1 and the wild stain SM6

3 討論

基因敲除是研究微生物蛋白功能重要的方法。細菌基因敲除有多種策略，包括非復制型質(zhì)粒載體敲除法、不穩(wěn)定型質(zhì)粒載體敲除法、溫度敏感型質(zhì)粒載體敲除法、線形轉(zhuǎn)化敲除法和結(jié)合轉(zhuǎn)化敲除法[5]。同源重組是目前最常用的細菌基因突變方法，Red重組技術(shù)應用于沙門菌染色體DNA、大腸桿菌染色體DNA、細菌人工染色體基因組DNA 中，Red 重組技術(shù)也可以精確修飾不同大小的DNA 分子[6-9]。

由于毒力島SPI-1 編碼的堿基長達40 kb，應用的常規(guī)Red 重組方法難以將S.enterica 毒力島SPI-1敲除。本實驗室前期基于I-SceI 酶切原理對pKD46質(zhì)粒進行改造，構(gòu)建pKD46a。本研究利用這種改進的Red 重組系統(tǒng)，通過一步法構(gòu)建了SM6ΔSPI-1，不需要再將毒力島基因進行逐段敲除。改進的Red系統(tǒng)與常規(guī)方法相比具有快速、準確、高效的優(yōu)勢。

另外，SM6ΔSPI-1 遺傳穩(wěn)定性試驗顯示，SM6ΔSPI-1 具有良好的遺傳穩(wěn)定性。SM6ΔSPI-1 的生長速率較SM6 快，表明毒力島SPI-1 的缺失可能減少SM6 生長負擔，推測SPI-1 中某些組分的合成導致沙門菌生長變緩。本實驗還在敲除毒力島SPI-1過程中檢測了幾代菌液制成感受態(tài)細胞，結(jié)果顯示傳10 代后的菌液更利于質(zhì)粒pCP20 的導入。表明菌液里的pKD46a 質(zhì)粒影響質(zhì)粒pCP20 的轉(zhuǎn)入，傳代次數(shù)增多使質(zhì)粒pKD46a 自然丟失?？傊琒.enterica 毒力島SPI-1 的敲除為其后續(xù)功能研究奠定了基礎，為制備基因工程減毒疫苗提供一種快捷的缺失方法。

[1]Kaniga K,Trollinger D,Galan J E.Identification of two targets of the type III protein secretion system encoded by the inv and spa loci of Salmonella typhimurium that have homology to the Shigella IpaD and IpaA proteins[J].J Bacteriol,1995,177(24):7078-7085.

[2]Chen L M,Kaniga K,Galan J E.Salmonella spp.are cytotoxic for cultured macrophages[J].Mol Microbiol,1996,21(5):1101-1115.

[3]Ginocchio C C,Rahn K,Clarke R C,et al.Naturally occurring deletions in the centisome 63 pathogenicity island of environmental isolates of salmonella spp[J].J Infect Immun,1997,65(4):1267-1272.

[4]Datsenko K A,Wanner B L.One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K12 using PCR products[J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(12):6640-6645.

[5]謝承佳，何冰芳，李霜.基因敲除技術(shù)及其在微生物代謝工程方面的應用[J].生物加工過程，2007，(3)：10-14.

[6]孟霞，孟憲臣，朱春紅，等.腸炎沙門菌hfp 缺失株的構(gòu)建和對flic 基因的調(diào)控分析[J].中國預防獸醫(yī)學報，2013，35(9)：720-724.

[7]崔文禹，李山虎，姜飛，等.應用Red 重組工程技術(shù)建立asd 基因缺失的大腸桿菌DH10B 菌株[J].生物技術(shù)通訊，2006，17(4)：493-495.

[8]Muyrers J P,Zhang You-ming,Testa G,et al.Rapid modification of bacterial artificial chromosomes by ET recombination[J].Nucleic Acids Res,1999,27(6):1555-1557.

[9]楊建嶺，顧淑萍，陳臣，等.用Red/ET 重組酶構(gòu)建基因打靶載體[J].生物工程學報，2006，22(6)：919-924.