喬香君，李 靜*，程相朝，張春杰，李銀聚，陳松彪，武建琳，李圣杰，袁乾亮

(1.河南省動物疫病與公共安全院士工作站，河南 洛陽 471003；2.河南科技大學(xué) 動物疫病與公共衛(wèi)生重點實驗室，河南 洛陽 471003)

鼠傷寒沙門菌(Salmonella typhimurium)為腸桿菌科沙門菌屬成員，是一種條件性胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性腸桿菌，具有廣泛的宿主感染譜，主要引起動物的腸道性和人類的食源性疾病，在公共衛(wèi)生學(xué)方面具有重要意義[1-2]。

自噬作為機體的一種免疫機制，為研究其在沙門菌感染過程中是否發(fā)揮作用，沙門菌感染是否可以引起宿主腸道發(fā)生自噬，本研究以消化道感染途徑為切入點，結(jié)合目前世界對自噬的研究熱點，建立動物感染模型，應(yīng)用透射電子顯微鏡技術(shù)和western blot 方法，從細(xì)胞和蛋白水平觀察鼠傷寒沙門菌SL1344 經(jīng)消化道感染后，BALB/c 小鼠腸道自噬現(xiàn)象，揭示自噬在沙門菌感染過程中的作用，從而為深入研究機體的免疫調(diào)節(jié)提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株及實驗動物 鼠傷寒沙門菌SL1344 由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)饋贈；6～8 周齡清潔級BALB/c 小鼠由鄭州大學(xué)動物實驗中心提供。

1.2 主要試劑 LB 培養(yǎng)基購自英國OXOID 公司；兔抗鼠LC3-II 抗體購自Sigma 公司；HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG(IgG-HRP)購自蘇州拜吉氏生物科技有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒及ECL 化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 感染小鼠模型的建立 將鼠傷寒沙門菌接種于LB 培養(yǎng)基中，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)，待細(xì)菌生長到對數(shù)期，對其進(jìn)行菌落計數(shù)，并稀釋為3 個不同濃度：107cfu、108cfu 及109cfu 感染小鼠，篩選最佳感染劑量。30 只BALB/c 小鼠隨機分為3 組，每組10 只。第1 組和第2 組經(jīng)口腔接種鼠傷寒沙門菌，第3 組口服接種相同體積的無菌生理鹽水，接種后7 d 迫殺第1 組小鼠，接種后14 d 分別迫殺第2 組和對照組小鼠，采集小鼠空腸。

1.4 感染小鼠腸組織病理組織學(xué)觀察 鼠傷寒沙門菌SL1344 感染BALB/c 小鼠后7 d 和14 d，迫殺小鼠后迅速采集小鼠空腸，經(jīng)10 %甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，H E 染色后進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察。

1.5 透射電鏡技術(shù)觀察感染小鼠腸道自噬現(xiàn)象SL1344 菌株感染BALB/c 小鼠后7 d、14 d，迅速采集小鼠空腸，進(jìn)行組織修塊后置于用0.15 M PBS(pH7.4)配制的2 %甲醛/2.5 %戊二醛中。固定1 h，轉(zhuǎn)移至1%四氧化鋨/0.15 M PBS 緩沖液中固定1 h，經(jīng)不同濃度的乙醇進(jìn)行脫水處理，包埋，切成1 μm的切片，置于載玻片上后用1 %甲苯胺藍(lán)染色，先在光學(xué)顯微鏡下觀察并確定部位。切成70 nm～80 nm，經(jīng)4 %醋酸鈾酰染色15 min，檸檬酸鉛8 min，利用透射電鏡進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察。

1.6 感染小鼠腸道中LC3-II蛋白表達(dá)情況的檢測采集小鼠空腸，稱重，液氮研磨成粉狀。取適量裂解液加入PMSF，使其終濃度為1 mM。按100 μL～200 μL 裂解液/20 mg 組織的比例加入裂解液，漩渦振蕩，置4 ℃孵育30 min。待組織充分裂解后，4 ℃10 000 r/min 離心5 min，取上清液，采用BCA 法測定樣品蛋白質(zhì)的濃度。將蛋白樣品經(jīng)15 % SDSPAGE 電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上；以兔抗鼠LC3-II抗體(1∶1 000)為一抗，山羊抗兔IgG-HRP(1∶2 000)為二抗，ECL 曝光顯影進(jìn)行western blot 檢測。

2 結(jié)果

2.1 鼠傷寒沙門菌感染小鼠模型的建立 以不同劑量的鼠傷寒沙門菌感染小鼠，結(jié)果顯示108cfu 的接種劑量小鼠的發(fā)病效果比較理想。第1 組和第2 組小鼠每只經(jīng)口腔接種108cfu 菌液，第3 組小鼠每只口服接種相同體積的生理鹽水，在接種后7 d、14 d分別迫殺實驗組1、2 和對照組小鼠，采集小鼠空腸。

2.2 感染小鼠腸組織病理形態(tài)學(xué)觀察 將腸組織切片HE 染色后進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察。結(jié)果顯示，SL1344 菌株感染小鼠后7 d，空腸黏膜上皮脫落、缺損(圖1A)，感染后14 d，空腸中出現(xiàn)大量的炎性細(xì)胞浸潤，杯狀細(xì)胞數(shù)量增多(圖1B)。

圖1 空腸組織病理形態(tài)學(xué)觀察(10×，HE)Fig.1 Histopathologic morphology observation of jejunum(10×,HE)

2.3 感染小鼠腸道超微結(jié)構(gòu)觀察 鼠傷寒沙門菌SL1344 感染BALB/c 小鼠后7 d 和14 d，采集小鼠空腸，對組織進(jìn)行固定，經(jīng)過處理后利用透射電鏡進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察。結(jié)果顯示，鼠傷寒沙門菌SL1344 感染可以引起小鼠腸道發(fā)生自噬(圖2B)，并且引起細(xì)胞線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹(圖2E 和2H)。

2.4 感染小鼠腸道中LC3-II蛋白表達(dá)情況 采集小鼠空腸，提取蛋白并檢測蛋白濃度后，利用western blot 方法檢測感染小鼠腸道中LC3-II 蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組LC3-II 蛋白表達(dá)量均增加(圖3)。

圖2 鼠傷寒沙門菌感染小鼠腸道透射電鏡觀察結(jié)果Fig.2 Intestinal TEM observations of mice infected with S.typhimurium

圖3 Western blot 方法檢測LC3-II 的表達(dá)水平Fig.3 Western blot detection of LC3-II expression level

3 討論

鼠傷寒沙門菌是一種重要的人畜共患病原菌，其感染發(fā)病率居沙門菌感染的首位。正常生理情況下，機體能夠抵御沙門菌入侵，但在腸道菌群失調(diào)或機體抵抗力下降等各種因素影響下，均有利于沙門菌感染的發(fā)生[3]。自噬作為天然免疫應(yīng)答的一種，在病原體防御過程中發(fā)揮著重要作用[4]。病原體侵入細(xì)胞后，自噬通過膜結(jié)構(gòu)對其進(jìn)行包裹形成自噬體，隨后自噬體與溶酶體發(fā)生融合形成自噬溶酶體，最后溶酶體中的蛋白酶對病原體進(jìn)行降解[5]。LC3-II 基因參與自噬體的形成，目前已作為自噬的標(biāo)記性分子用于自噬活性的檢測[5]。本研究構(gòu)建了鼠傷寒沙門菌SL1344 感染小鼠模型，利用透射電鏡技術(shù)觀察到自噬體的存在。此外，western blot 方法檢測顯示，鼠傷寒沙門菌SL1344 感染小鼠空腸組織中LC3-II 的表達(dá)量顯著增加，這進(jìn)一步表明鼠傷寒沙門菌感染可以引起小鼠腸道發(fā)生自噬。

作為機體免疫的一部分，自噬對多種病原體具有清除作用，即病原體能夠被自噬直接殺傷或者通過先天性或獲得性免疫間接被消滅。然而，一些病原體能夠逃避自噬的識別，甚至利用自噬為其自身的復(fù)制提供便利[6]。由此表明，自噬在機體免疫過程中發(fā)揮著“雙刃劍”的作用，然而自噬逃避機制目前尚不清楚[7-8]。本研究結(jié)果表明鼠傷寒沙門菌SL1344 可以引起B(yǎng)ALB/c 小鼠腸道細(xì)胞發(fā)生自噬現(xiàn)象，這種自噬現(xiàn)象對沙門菌的感染是否具有清除作用還有待于深入研究。

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