楊延輝，趙建新，王浩，擺茹，韓梅

（寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004）

·綜述與專論·
REVIEW AND MONOGRAPH

泛酸激酶及其抑制劑的研究進(jìn)展

楊延輝，趙建新，王浩，擺茹，韓梅*

（寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004）

輔酶A的生物合成對于病原微生物的生存及致病性至關(guān)重要，而作為輔酶A生物合成途徑的限速酶——泛酸激酶控制著輔酶A生物合成的起始步驟，且其普遍存在于病原體，并與人體中的同源蛋白相似度極低，故引起人們廣泛興趣，成為潛在的新型抗菌靶標(biāo)研究的熱點(diǎn)，其小分子抑制劑有望開發(fā)成為具高選擇性、低毒副作用的抗菌藥。綜述泛酸激酶的分類、特性、晶體結(jié)構(gòu)特征及其調(diào)控和成為潛在抗菌藥物靶標(biāo)的可行性，并概述具不同結(jié)構(gòu)類型和抗病原微生物活性的在研泛酸激酶抑制劑。

泛酸激酶；輔酶A；抑制劑；抗病原微生物活性

輔酶A(coenzymeA，CoA，1)廣泛存在于生物體內(nèi)，是轉(zhuǎn)運(yùn)一碳基團(tuán)所必需的輔助因子，是體內(nèi)重要的?；d體，參與糖代謝、脂肪酸合成與氧化、血紅素合成、丙酮酸降解、氨基酸分解和乙酰膽堿合成與乙?；却x過程[1]。CoA生物合成從泛酸（2）開始，需5步酶促反應(yīng)，分別由coaA、coaB、coaC、coaD和coaE基因編碼的酶完成，其間分別生成化合物3～6（見圖1）[2]，而泛酸激酶（pantothenatekinase，即原核生物中CoaA，真核生物中PanK)又稱ATP:D-泛酸-4’-磷酸轉(zhuǎn)移酶(EC.7.1.33)，是CoA生物合成途徑的限速酶，被認(rèn)為是抗菌藥物開發(fā)的潛在新靶點(diǎn)，且其突變與人類神經(jīng)退行性病變相關(guān)[3-4]。鑒于泛酸激酶的重要性，本文對該酶及其抑制劑的研究現(xiàn)狀作一綜述。

圖1 從泛酸開始的CoA生物合成路線Figure 1 Biosynthetic route from pantothenic acid to CoA

1 泛酸激酶的分類

泛酸激酶具有3種類型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，其中，Ⅰ型以大腸埃希菌的泛酸激酶(EcCoaA)為代表；Ⅱ型以金葡菌的泛酸激酶（SaCoaA）為代表，主要存在于真核生物中，包括哺乳動物來源的4種亞型：mPanK1、mPanK2、mPanK3和mPanK4；Ⅲ型主要存在于病原微生物中，如幽門螺旋桿菌、銅綠假單胞菌、炭疽芽胞桿菌和結(jié)核分枝桿菌（Mtb）等。

在一個生物體中，可以存在多種類型的泛酸激酶，比如Mtb和枯草芽孢桿菌同時含有Ⅰ型和Ⅲ型，但缺乏Ⅱ型[5-6]。迄今，應(yīng)用比較基因組學(xué)進(jìn)行序列比對時發(fā)現(xiàn)，幾乎所有生物體（包括古細(xì)菌[7]）中都含有泛酸激酶相關(guān)基因。

2 泛酸激酶的特性

2.1 Ⅰ型泛酸激酶

Ⅰ型泛酸激酶最初是從沙門氏菌和大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)。EcCoaA由coaA基因編碼，有兩個轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。EcCoaA主要以相對分子質(zhì)量為36000的同源二聚體形式存在，屬于P環(huán)激酶超家族，其對泛酸和ATP的親和常數(shù)(Km）分別為36和136μmol·L-1(Song等, J Bacteriol,1992年)。由于結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，EcCoaA與底物的結(jié)合具有一定的選擇特異性[8]，酶動力學(xué)實驗證明其與ATP的結(jié)合符合正協(xié)同序變模型。Song等（J Bacteriol,1992年）將大腸埃希菌菌株中EcCoaA的表達(dá)量提高76倍，卻僅使其催化合成的終產(chǎn)物CoA增加了2.7倍，說明EcCoaA可被CoA反饋抑制。另外，CoA硫酯對EcCoaA也有一定的抑制作用(Rock等,J Bacteriol,2003年）。

2.2 Ⅱ型泛酸激酶

Ⅱ型泛酸激酶最初是從構(gòu)巢曲霉中發(fā)現(xiàn)，與Ⅰ型泛酸激酶在序列上無相似性，構(gòu)巢曲霉的panK基因位于3號染色體上并由3個內(nèi)含子隔開。Ⅱ型泛酸激酶對泛酸和ATP的Km分別為60和145μmol·L-1，其可被乙酰CoA抑制，而CoA對該酶的反饋抑制作用比CoA硫酯強(qiáng)（Calder等,J Biol Chem,1999年)。

SaCoaA與哺乳動物泛酸激酶（mPanK）的催化中心最為相似，其以同源二聚體形式存在，對泛酸和ATP的Km由 Choudhry等（AntimicrobAgentsChemother,2003年）報道分別為（27±7）和（93±18）μmol·L-1，而Leonardi等[9]報道分別為23和34μmol·L-1，且均表明ATP濃度低時酶活性更好。SaCoaA不會被CoA反饋抑制，其在細(xì)胞內(nèi)催化合成的CoA濃度可累積達(dá)毫摩爾級[10]。

mPanK首次在小鼠中發(fā)現(xiàn)，其基因由7個內(nèi)含子和8個外顯子組成，而按1號外顯子的不同，其又可分成PanK1α和PanK1β兩種亞型。PanK1α可被CoA、乙酰CoA和丙二酰CoA抑制，其中CoA抑制作用最弱；PanK1β則不被CoA抑制，乙酰CoA的抑制作用也較弱(Rock等,J Biol Chem,2000年)。

人類的4種PanK的催化中心區(qū)域都高度保守，一致性在83%以上。其中，PanK2蛋白靶向于線粒體，并與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生具有一定的相關(guān)性[4]，而panK2基因位于染色體20p12.3-p12，含有7個外顯子，每個外顯子上都會發(fā)生引起病變的突變，如2號外顯子上H173Y[11]和Y227C[12]、3號外顯子上D378G[13]與4號外顯子上R440P的突變[14]以及5號外顯子上可引發(fā)PanK2上1142位到1144位的3個核苷酸GAG缺失的突變[15]。人類的泛酸激酶受CoA及其乙酰脂類的抑制[10]。

總之，真核生物中的Ⅱ型泛酸激酶雖然與原核生物的Ⅱ型泛酸激酶具有相似的一級結(jié)構(gòu)，但它們的酶動力學(xué)和調(diào)控機(jī)制等存在顯著差異。

2.3 Ⅲ型泛酸激酶

在炭疽芽胞桿菌中發(fā)現(xiàn)，泛酸激酶基因coaX能修復(fù)大腸埃希菌coaA15(Ts)缺陷株，表明該基因編碼一種新型泛酸激酶，并命名為CoaX[16]，該酶屬于ASKHA家族。炭疽芽胞桿菌和幽門螺旋桿菌中的泛酸激酶對泛酸的Km分別為168和101μmol·L-1，對ATP的Km分別為3和10mmol·L-1[17]。Ⅲ型泛酸激酶不受CoA和乙酰CoA的抑制，且不以N取代的泛酸酰胺類藥物為底物催化合成類似于CoA的抗代謝物[18]。

綜上所述，3種類型的泛酸激酶在氨基酸序列、調(diào)控模式以及對底物的親和性和特異性上都有很大差異，表1對它們的特性進(jìn)行了匯總比較并列舉了其代表性抑制劑。

表1 3種類型泛酸激酶的特性比較及其代表性抑制劑Table 1 Comparison of the properties of three types of pantothenate kinases and their representative inhibitors

3 泛酸激酶晶體結(jié)構(gòu)特征

Ⅰ型泛酸激酶與CoA或ATP類似物AMPPNP的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)顯示，CoA的α和β磷酸與AMPPNP的β和γ磷酸占據(jù)了激酶的相同位點(diǎn)Lys101。而CoaA·ADP·泛酸三元復(fù)合物的結(jié)構(gòu)分析明確了CoaA上與泛酸結(jié)合的氨基酸殘基，且經(jīng)序列比對發(fā)現(xiàn)，這些氨基酸殘基在多種細(xì)菌中都是保守的，尤其是Asp127和Tyr240[19]。經(jīng)含有CoaA·ADP·泛酸和CoaA·CoA的泛酸激酶晶體結(jié)構(gòu)疊合對比，發(fā)現(xiàn)泛酸、ADP和CoA使用了相同的結(jié)合口袋；而將泛酸酰胺類似物N5-Pan和泛酸激酶進(jìn)行分子對接，則發(fā)現(xiàn)每種配體的結(jié)合都會產(chǎn)生一種不同的蛋白構(gòu)象[20]。

Ⅱ型和Ⅲ型泛酸激酶都含有核糖核酸酶H類似的結(jié)構(gòu)。SaCoaA的泛酸結(jié)合口袋可與ATP牢固結(jié)合，需要一價陽離子來抵消口袋的電荷，從而削弱口袋對ATP的結(jié)合，使ATP易于與口袋解離，而活性中心人PanK2與SaCoaA的結(jié)構(gòu)和底物結(jié)合機(jī)制均相似。然而，泛酸結(jié)合到銅綠假單胞菌的Ⅲ型泛酸激酶催化口袋后，酶活性中心的P環(huán)結(jié)構(gòu)可與ATP的腺嘌呤部分特異性匹配，但該酶與底物形成的氫鍵和范德華力弱于Ⅱ型激酶，導(dǎo)致其與ATP的結(jié)合能力不及Ⅱ型激酶[18]。而且，由于Ⅲ型泛酸激酶二聚體的活性中心口袋相對狹小，使得泛酸及其類似物（如泛酸酰胺類化合物）不易進(jìn)入酶活性中心。所以，含Ⅲ型泛酸激酶的細(xì)菌會對泛酸酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥性。

4 輔酶A生物合成和泛酸激酶的調(diào)控

CoA的生物合成調(diào)節(jié)方式主要包括體內(nèi)CoA的區(qū)域化分布、合成過程的反饋調(diào)節(jié)、CoA合成的關(guān)鍵酶的基因表達(dá)調(diào)節(jié)和CoA的降解調(diào)節(jié)[10]。在CoA的生物合成途徑中，最主要的調(diào)控酶是泛酸激酶和4-磷酸泛酰巰基乙胺腺苷轉(zhuǎn)移酶（CoaD）。CoA可與ATP酶的活性中心競爭性結(jié)合，從而對其生物合成產(chǎn)生負(fù)調(diào)控作用（Rock等,J Biol Chem,2000年），而CoaD則主要由CoA與底物4’-磷酸泛酰巰基乙胺競爭性結(jié)合于酶活性中心位點(diǎn)而被反饋抑制。泛酸激酶的基因表達(dá)水平較低有2個原因：1）coaA基因的啟動子與其他基因的啟動子同源性低；2）泛酸激酶使用了稀有密碼子[10]。

5 泛酸激酶成為潛在抗菌藥物靶標(biāo)的可行性

幾乎所有病原微生物中都存在CoaA基因，且有些病原微生物中CoaA基因過表達(dá)或者含有多拷貝coaA基因，如炭疽芽孢桿菌和Mtb等。

真核和原核生物的泛酸激酶研究成果表明，它們的序列同源性極低，即使有些在序列上具有相似性，但其動力學(xué)特性和調(diào)節(jié)方式仍存在差異，且泛酸激酶的天然抑制劑CoA及其硫酯對不同來源的泛酸激酶具有不同的抑制活性。此外，Mtb與大腸埃希菌中的Ⅰ型泛酸激酶（MtbCoaA和EcCoaA）在結(jié)構(gòu)上非常相似（見圖2），且泛酸結(jié)合區(qū)域的氨基酸序列非常保守，但在進(jìn)行酶促反應(yīng)時其配基結(jié)合位點(diǎn)會發(fā)生改變（見圖3）。再者，MtbCoaA對泛酸和ATP的Km都高于EcCoaA。因此，不同來源的泛酸激酶的結(jié)構(gòu)和活性特異性使得設(shè)計與開發(fā)出專門針對于病原微生物，且選擇特異性高的CoaA抑制劑成為可能[21-22]，CoaA也就成為抑制CoA生物合成和病原微生物生長的首選靶標(biāo)。

圖2 MtbCoaA的結(jié)構(gòu)Figure 2 Structure of MtbCoaA

圖3 泛酸激酶中泛酸結(jié)合區(qū)域的構(gòu)象Figure 3 Conformation of the pantothenate-binding region in pantothenate kinase

6 泛酸激酶抑制劑

截至目前發(fā)現(xiàn)的CoaA抑制劑化合物種類主要包括 泛磺酸及其衍生物、泛醇、N-泛酰取代胺、泛酰肼及其衍生物、泛氨酮（pantothenone）及其衍生物、泛酸類似物、N-取代泛酰胺（pantothenamide）、苯三唑類化合物、聯(lián)芳乙酸衍生物和天然泛酸類似物等（見圖4）。

6.1 泛磺酸及其衍生物

泛磺酸(7)是首個報道具有體外抗菌活性的泛酸類似物，對大腸埃希菌、乳酸菌、鏈球菌和白喉棒狀桿菌等都有抑制活性，其體外MIC分別為4.8～6.1g·L-1、3.7～13.8g·L-1、0.9～4.0g·L-1和2～50μmol·L-1，且它對不同細(xì)菌的抑制活性同介質(zhì)中泛酸的濃度有很大關(guān)系，即至少泛磺酸的濃度較泛酸高500倍以上，其才能發(fā)揮抗菌作用（McIlwain,Biochem J,1942年）。體內(nèi)研究表明，以2.2g·kg-1劑量給予泛磺酸，對高致病性鏈球菌感染的大鼠能起保護(hù)作用（McIlwain等,Lancet,1943年）。需要如此高的治療劑量方能顯效，是限制泛磺酸進(jìn)一步研發(fā)的主要因素。

泛磺酰胺（8）是泛酸的磺胺類似物，溶解性低于泛磺酸，使其在血液中維持時間更長，其以2.2g·kg-1劑量給予模型大鼠所產(chǎn)生的活性優(yōu)于同劑量泛磺酸。泛磺酸衍生物9、10和11a體外抗菌的MIC同泛磺酸接近，而衍生物11b和11c的體外抗菌活性則有所提高，且11b具有比泛磺酸更好的體內(nèi)活性，但衍生物9的毒性較高。合成的芳基取代泛磺酸衍生物12和13無體外抗菌活性，N-取代泛磺酰胺（14a-d）的體外抗鏈球菌活性優(yōu)于泛磺酸。而且，泛磺酸及其衍生物僅有右旋結(jié)構(gòu)具抑菌活性(White等,J Am Chem Soc,1946年；Winterbottom等,J Am Chem Soc,1947年)。

6.2 泛醇和N-泛酰取代胺

曾有研究認(rèn)為泛醇（15）能占據(jù)泛酸激酶的活性中心并產(chǎn)生競爭性抑制作用，而Kumar等[23]的研究發(fā)現(xiàn)泛酸可致使泛醇磷酸化。泛醇對含Ⅱ型泛酸激酶的金葡菌具有抑制作用，對泛酸激酶的IC50可達(dá)64μmol·L-1，對該菌的MIC為2mmol·L-1[24]。而ω-甲基泛醇（16）對乳酸菌的MIC約為100μmol·L-1（Drell等,Arch Biochem Biophys,1954年）。不過，右旋泛醇抗腸膜狀明串珠菌（Leuconotoc mesenteroides）的活性優(yōu)于泛磺酸，但抗其他微生物的作用不及泛磺酸，且在體內(nèi)會轉(zhuǎn)化為泛酸(Snell等,J Biol Chem,1945年)，因此它不是非常理想的抗菌劑。

為解決上述問題，人們合成了一系列泛醇衍生物——N-泛酰取代胺（17）。其中，N-泛酰烷基胺（17c）抗乳酸菌的活性最好，其次是化合物17a，它在濃度高于泛酸5倍時即能有效抑制乳酸菌的生長，而化合物17b再次之，但其活性仍優(yōu)于泛醇；化合物17d的抗鏈球菌活性最好；化合物17e也具有體外抗菌和抗瘧原蟲活性[25]，且在體內(nèi)不會轉(zhuǎn)化成泛酸，其體內(nèi)活性有待進(jìn)一步研究。

6.3 泛酰肼及其衍生物

Madinaveitia等合成了泛酰肼及其衍生物（18～21），并在體外實驗中發(fā)現(xiàn)，在10μmol·L-1的D,L-泛酸存在的情況下，泛酰肼（18）抑制乳酸菌的活性略強(qiáng)于泛磺酸，且將D,L-泛酸濃度再提高0.1μmol·L-1時，其抗菌活性可提高50倍以上；泛酰胺（19）、化合物20和21都具有抑制乳酸菌活性，而化合物20和21還具有抑制鏈球菌活性（Madinaveitia等,BiochemJ,1945年）。這類化合物的抗菌譜及體內(nèi)抗菌活性尚有待進(jìn)一步研究。

6.4 泛氨酮及其衍生物

D-甲基泛氨酮（22）和D-苯基泛氨酮（23）均屬于非泛酸競爭性抑制劑，前者對乳酸菌和酵母菌的IC50分別為460和2300μmol·L-1，后者對干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、溶血性鏈球菌、大腸埃希菌、金葡菌、產(chǎn)脂內(nèi)孢霉（Endomyces vernalis）和釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）的IC50分別為190、220、7200、500、140和120μmol·L-1。此外，D-對甲苯基泛氨酮（24）也具有抗乳酸菌活性[25]。

6.5 泛酸類似物

ω-甲基泛酸（25）在體內(nèi)外實驗中都能顯示出抗溶血性鏈球菌活性，其MIC約為50μmol·L-1，但它也能引起哺乳動物體內(nèi)泛酸缺乏；此外，β取代的泛酸類似物的抗菌活性強(qiáng)于ω取代類似物(Drell等,Arch Biochem Biophys,1954年)。高泛酰牛磺酸（26）是泛酸激酶的競爭性抑制劑，但其抗菌作用不及泛磺酸(Mcilwain等,Biochem J,1942年)?；衔?27)為I型泛酸激酶的抑制劑[26]，目前尚無抗菌活性數(shù)據(jù)。

6.6 N-取代泛酰胺

N-取代泛酰胺衍生物發(fā)揮抗菌活性的作用機(jī)制是，通過競爭性結(jié)合于泛酸激酶而干擾CoA的代謝[27]。N-戊基泛酰胺(28a)和N-庚基泛酰胺(28b)具有抗金葡菌活性，MIC分別為25和0.16μmol·L-1，它們雖然對I型和Ⅱ型泛酸激酶有抑制活性，卻對Ⅲ型酶無抑制作用[28]。這類泛酸激酶抑制劑可通過體內(nèi)代謝而轉(zhuǎn)化為可使?；d體蛋白失活的化合物，從而進(jìn)一步有效抑制細(xì)菌細(xì)胞膜的生物合成。體外抗菌活性研究發(fā)現(xiàn)，末端具有反式烯丙基的N-戊基泛酰胺(29)的抗菌活性較好，對敏感和耐藥金葡菌的MIC可達(dá)3.2μmol·L-1，對大腸埃希菌的MIC為2μmol·L-1（Strauss等,J Biol Chem,2002年）。最新研究表明，N-戊基泛酰胺末端二烴基構(gòu)象的改變能使其顯示出不同的生物學(xué)活性，當(dāng)末端的反式烯丙基變?yōu)轫樖?30)時，其具有抗瘧原蟲活性，IC50為（2.4±0.2）μmol·L-1[29]。

6.7 苯三唑和聯(lián)芳乙酸衍生物

針對Mtb的Ⅰ型泛酸激酶開展的研究發(fā)現(xiàn)，苯三唑類化合物（31）具有泛酸激酶抑制活性，IC50可達(dá)0.05μmol·L-1，可遺憾的是其無體外抗Mtb活性。因此，需對此類化合物開展進(jìn)一步的構(gòu)效關(guān)系研究，以發(fā)現(xiàn)具有抗菌活性的泛酸激酶抑制劑[21-30]。另有研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)芳乙酸衍生物(32a-c)具有體外抗Mtb作用，MIC為4～16mg·L-1[22]。

6.8 天然泛酸類似物

CJ-15801(33)是從真菌Seimatosporium sp.CL28611中分離得到的1個天然泛酸類似物，同泛酸的差異是β-丙氨酸部分含有一個雙鍵，其對多藥耐藥金葡菌具有抑制作用，MIC為6.25～50mg·L-1[31]。目前，CJ-15801及其酯類衍生物已被全合成[32-33]，為進(jìn)一步開展此類化合物的抗菌譜及體內(nèi)外活性研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖4 截至目前發(fā)現(xiàn)的泛酸激酶抑制劑結(jié)構(gòu)類型Figure 4 The structure types of pantothenate kinase inhibitors found so far

7 結(jié)語

鑒于世界范圍內(nèi)多藥和極端耐藥病原菌不斷增多，急需開發(fā)新的藥物靶點(diǎn)和治療策略，而探索并鑒定可能成為新型抗菌藥物靶點(diǎn)的病原微生物關(guān)鍵酶，則是意義深遠(yuǎn)的創(chuàng)新性研究。綜上所述，CoA在生物體內(nèi)的諸多代謝過程中發(fā)揮重要作用，而泛酸激酶是CoA生物合成中的限速酶，且病原微生物與哺乳動物中的泛酸激酶在序列上、代謝動力學(xué)和調(diào)節(jié)上均存在顯著差異，使得泛酸激酶成為新型抗菌藥物研發(fā)的理想靶點(diǎn)，并有可能設(shè)計和開發(fā)出特異性靶向病原菌的泛酸激酶抑制劑。目前泛酸激酶抑制劑設(shè)計的主要思路包括尋找底物類似物和反應(yīng)過渡態(tài)類似物以及建立高通量篩選模型對已有的化合物庫進(jìn)行篩選，藉此已發(fā)現(xiàn)了一些泛酸激酶抑制劑，其中CoA類似物是最具特異性抑制活性的化合物，有些還表現(xiàn)出體內(nèi)外抗菌活性。當(dāng)然，眼下的相關(guān)研究仍處于探索階段，以泛酸激酶作為有效靶標(biāo)開發(fā)出高選擇性的抗病原微生物藥物，尚需大量的實驗研究支持。

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Pantothenate Kinase and Its Inhibitors：Current Research Status

YANG Yanhui, ZHAO Jianxin, WANG Hao, BAI Ru, HAN Mei
( School of Basic Medicine, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China)

The biosynthesis of coenzyme A(CoA) plays a vital role in the survival and virulence of pathogenic microorganism. Pantothenate kinase as the rate-limiting enzyme controls the starting step in CoA biosynthesis, which is widespread in the pathogen and of which the similarity to homologous proteins in human is extremely low. Therefore, the kinase has gained much of people’s interest and has become a hot spot of research for potential new type of antibacterial targets. Its small molecule inhibitors are expected to be developed into the antimicrobials with high selectivity and lowtoxicity.Theclassifcation,propertyandcrystalstructureofpantothenatekinaseanditsregulationaswellasthefeasibilityofitsuseasapotentialantibacterial target were reviewed. The pantothenic acid kinase inhibitors in development with different structures and activities against pathogenic microorganism were summarized.

pantothenate kinase; coenzyme A; inhibitor; anti- pathogenic microorganism activity

Q936; R978

A

1001-5094（2014）09-0641-08

接受日期：2014-08-27

項目資助：寧夏醫(yī)科大學(xué)特殊人才科研啟動項目（No.XT201319）

*通訊作者：韓梅，教授；

研究方向：病原生物學(xué)與免疫學(xué)；

Tel：0951-6980122；E-mail：hanmei0708@126.com