劉慧慧 何建瑜 趙榮濤 薛超波

(1.浙江海洋學(xué)院 國(guó)家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心 舟山 316004;2.舟山市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測(cè)研究院 舟山 316021)

厚殼貽貝(Mytilus coruscus)是一種棲息于海水中的常見(jiàn)雙殼經(jīng)濟(jì)貝類(lèi),北至遼寧大連,南至福建東山均有分布,以浙江沿海資源量最大,其軟體部蛋白質(zhì)含量較高,鮮味氨基酸和必需氨基酸組成豐富,微量元素構(gòu)成合理,屬營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值都較高的海產(chǎn)貝類(lèi)(何建瑜等,2012),已發(fā)展為浙江沿海重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖品種。但隨著近年來(lái)沿海城市工業(yè)化進(jìn)程的加速,厚殼貽貝繁殖的周邊海域水質(zhì)、環(huán)境因子持續(xù)惡化,生境污染不斷加劇,作為一種典型的濾食性潮間帶生物,厚殼貽貝因具有個(gè)體較大,生活史較長(zhǎng),活動(dòng)性差,容易采集,對(duì)環(huán)境污染物(如重金屬、病原微生物等)具有很強(qiáng)的耐受性等特征,常被作為環(huán)境指示生物來(lái)監(jiān)測(cè)海區(qū)環(huán)境的變化。

谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferase,GST)是多功能解毒酶超家族中的一員(雷安平等,2009;張妍,2012),主要在抗毒機(jī)制第II階段起作用,因此也稱(chēng)為 II相解毒酶,在生物體內(nèi)起到抵抗外源物質(zhì)入侵和細(xì)胞毒性防御的作用(Saranya Revathyet al,2012;Umasuthanet al,2012),涉及細(xì)胞的去毒及毒素的解毒過(guò)程(Masellaet al,2005;Ohnumaet al,2011)。其作用機(jī)理是促進(jìn)還原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)的活性基團(tuán)—巰基與毒素結(jié)合形成親電子試劑(程煒軒等,2009),使親電的疏水化合物變成親水物質(zhì),易于從膽汁或尿液中排泄(Liaoet al,2006)。此外,GST通過(guò)催化過(guò)氧化氫的氧化還原反應(yīng),清除體內(nèi)由代謝反應(yīng)產(chǎn)生的氧自由基和過(guò)氧化物,參與體內(nèi)免疫反應(yīng)(羅凱婭等,2012),保護(hù)細(xì)胞免受外界脅迫造成的損傷(Blanchetteet al,2002;張永國(guó)等,2006)。另有研究證實(shí),GST中pi型能參與細(xì)胞的增殖調(diào)控,并通過(guò)各種基因控制的酶在抗氧化反應(yīng)中協(xié)同作用發(fā)揮功能(Salinaset al,1999,Fuet al,2012),可以作為生物受環(huán)境污染的指示標(biāo)記物,其表達(dá)水平在一定程度上可以有效地反應(yīng)生物體受環(huán)境毒物的損害程度(Saranya Revathyet al,2012),該特征在硬殼蛤(Mercenaria mercenaria)(Blanchetteet al,2002)及太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)(Boutetet al,2004)中均有報(bào)道。

GST在生命活動(dòng)過(guò)程中有解毒、抗氧化等保護(hù)細(xì)胞的作用,而且對(duì)污染物有敏感反應(yīng),常作為生物標(biāo)志物。厚殼貽貝因?qū)Νh(huán)境污染物具有耐受性,而常被用作污染指示生物來(lái)監(jiān)測(cè)海區(qū)環(huán)境的變化。因此,為研究厚殼貽貝 GST基因在代謝活動(dòng)中的作用,以及分析該基因在海洋環(huán)境污染監(jiān)測(cè)中的指示作用,本文克隆了厚殼貽貝 GST基因,并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),以其血液中GST為分子標(biāo)記,監(jiān)測(cè)鎘、銅等重金屬脅迫下 GST基因的相對(duì)表達(dá)情況,以期為厚殼貽貝的大規(guī)模安全養(yǎng)殖及正確運(yùn)用其 GST分子作為環(huán)境污染預(yù)警提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

本次實(shí)驗(yàn)成體厚殼貽貝于2012年6月購(gòu)自舟山水產(chǎn)品市場(chǎng),平均殼長(zhǎng)9.3cm,平均殼高4.6cm,于25°C潔凈海水中暫養(yǎng)1周,每天換新鮮海水,定期投喂微綠球藻(Prochloroccus)和小球藻(Chlorella)。隨后將厚殼貽貝隨機(jī)分為2組,每組30只,并立即抽取各組的3只厚殼貽貝血液,提取總 RNA作為對(duì)照組,標(biāo)記為0d。實(shí)驗(yàn)采用 CuSO4·5H2O 和 CdCl2·5H2O 兩種重金屬進(jìn)行脅迫處理,將兩組貽貝分別置于含銅(Cu2+濃度為20μg/L)和鎘(Cd2+濃度為200μg/L)的10L 海水中,每天換一半含有相應(yīng)濃度重金屬的海水,定期投喂微綠球藻和小球藻,分別取處理后第5d、10d、15d、20d、30d的厚殼貽貝(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)取3只)血液提取總RNA。

1.2 總RNA提取和cDNA合成

用一次性針筒(5mL)快速?gòu)暮駳べO貝閉殼肌抽取血液,立即置于4°C 800r/min離心10min,沉淀用于總 RNA提取,方法按 TaKaRa公司的 Trizol Total RNA提取試劑盒推薦方法進(jìn)行,獲得的總 RNA以1.5%非變性瓊脂糖電泳檢測(cè),并置于紫外分光光度計(jì)(Bio-Rad,USA)下檢測(cè)其A260/A280值。以TaKaRa M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit試劑盒(TaKaRa)對(duì)所提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,獲得相應(yīng)cDNA。

1.3 厚殼貽貝GST基因克隆

根據(jù)已知海水雙殼貝類(lèi)紫貽貝(Mytilus galloprovincialis,AF527010)、地中海貽貝(Mytilus edulis,AY557404)、硬殼蛤(Mercenaria mercenaria,EU 024655)、河蜆(Corbicula fluminea,AY885667)、美洲簾蛤(Mercenaria mercenaria,EU024655)的GST基因通過(guò)Primer 5.0軟件在保守區(qū)設(shè)計(jì)兼并引物GST-F和GST-R(表1)。以厚殼貽貝血液 cDNA 為模板,克隆GST 基因。20μL 擴(kuò)增反應(yīng)體系:10×PCR Buffer 2μL,Mg2+(25mmol/L)2μL,dNTPs(2.5mmol/L)0.4μL,GST-F(10μmol/L)、GST-R(10μmol/L)各 0.8μL,ddH2O 13μL,Taq酶(5U/μL,TaKaRa)0.4μL,模板 cDNA 0.6μL。PCR擴(kuò)增條件:95°C預(yù)變性4min,94°C變性1min,53°C退火 30s,72°C延伸 45s,循環(huán) 35次;最后 72°C 延伸10min。以DL 2000 Marker為標(biāo)記,1.5 %瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物,選取與預(yù)期大小一致的約500bp的條帶用瓊脂糖膠純化試劑盒(TIANGEN)純化后,送上海英濰捷基生物公司測(cè)序。

表1 厚殼貽貝GST基因克隆及熒光定量所用的引物序列Tab.1 Primer sequences for GST cloning and real- time quantitive PCR in Mytilus coruscus

1.4 厚殼貽貝GST基因克隆序列分析

將雙向測(cè)序獲得的 cDNA序列利用 DNAstar7.0軟件進(jìn)行拼接,以 Clustal X1.8和 BLASTn(http://www.Ncbi.Nlm.Nih.gov/BLAST/)進(jìn)行序列同源性比對(duì),在MEGA4.1軟件中采取Neighbor-Joining算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),1000次重復(fù)計(jì)算Bootstrap值(Kumaret al,2004),進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.5 厚殼貽貝GST基因表達(dá)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

根據(jù)GST基因測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物qGST-F和qGST-R,采用RT-PCR法,以β-actin為內(nèi)參,分析 Cu2+和Cd2+脅迫下厚殼貽貝血液中 GST的表達(dá)情況(引物 qGST-F、qGST-R、β-actin-F、β-actin-R見(jiàn)表1)。20μL PCR 反應(yīng)體系:qGST-F(10μmol/L)與qGST-R(10μmol/L)各 0.8μL,2×SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ(TaKaRa)10μL,cDNA 0.8μL,ddH2O 7.6μL,反應(yīng)在ABI-7500型PCR儀上進(jìn)行,采用兩步法進(jìn)行擴(kuò)增,即95°C預(yù)變性1min,95°C變性10s,59.6°C延伸45s,共40個(gè)循環(huán),結(jié)束后,從55°C 緩慢升溫到95°C,制備熔解曲線(xiàn)。每次反應(yīng)都設(shè)置陰性對(duì)照和無(wú)模板對(duì)照,每個(gè)反應(yīng)3個(gè)重復(fù)孔。

1.6 數(shù)據(jù)處理

GST的相對(duì)表達(dá)量按用最小二乘法 2-ΔΔCT法計(jì)算(Pfaffl,2001),并利用SPSS 13.0進(jìn)行單因子顯著性差異分析(ANOVA)和t檢驗(yàn),分別標(biāo)記為顯著差異(P<0.05)和極顯著性差異(P<0.01)。

2 結(jié)果

2.1 基因擴(kuò)增及進(jìn)化發(fā)育分析

以反轉(zhuǎn)錄得到的血液cDNA為模板(總RNA濃度,A260/A280=1.91),用兼并性引物擴(kuò)增得到一條約500bp的特異性條帶,與預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小接近(圖1)。經(jīng) 3次測(cè)序確認(rèn)后的序列提交 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得GenBank序列號(hào)為 KC176684,通過(guò)BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn),該序列與紫貽貝(AF527010)和地中海貽貝(AY557404)的 pi型 GST基因均有較高的相似性(93%—94%),初步判斷所獲得的GST分子為pi型。選取人、猴、鼠、巨蠣及部分雙殼貝類(lèi)各種 GST亞型利用MEGA4.1構(gòu)建厚殼貽貝GST的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖2,結(jié)果發(fā)現(xiàn),Alpha、Zeta、Kappa、Pi、Omega、Mu和Sigma等7種亞型的GST基因之間相互成簇,各聚成一支;且每一種亞型中脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物的GST基因也相互分開(kāi),各聚成不同的亞支,說(shuō)明各亞型差別明顯,具有相對(duì)獨(dú)立的保守結(jié)構(gòu)域。厚殼貽貝GST與pi型GST雙殼貝類(lèi)位于同一進(jìn)化支,進(jìn)一步說(shuō)明本次實(shí)驗(yàn)獲得的GST基因歸屬于pi型,這與 BLAST的比對(duì)結(jié)果相似,同時(shí)也說(shuō)明厚殼貽貝GST與人、猴、鼠等在進(jìn)化上具有較大的差別。

圖1 GST擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig.1 The gel electrophoresis pattern of GST PCR product

2.2 Cu2+及Cd2+脅迫下厚殼貽貝GST基因表達(dá)

GST和內(nèi)參β-actin的擴(kuò)增曲線(xiàn)均呈“S”形,復(fù)孔間擴(kuò)增曲線(xiàn)重疊,指數(shù)區(qū)明顯、基線(xiàn)平整,陰性對(duì)照和無(wú)模板對(duì)照無(wú)擴(kuò)增,熔解曲線(xiàn)均為單一峰,擴(kuò)增效率達(dá) 100%±5%,說(shuō)明定量 PCR反應(yīng)體系良好,無(wú)非特異性擴(kuò)增,確保相對(duì)定量結(jié)果的準(zhǔn)確性(周向紅等,2011)。檢測(cè)發(fā)現(xiàn),厚殼貽貝GST受銅脅迫前幾天一直處于低水平表達(dá),至第10 d表達(dá)迅速達(dá)到最高,為對(duì)照組的6.95倍,接下來(lái)的10 d內(nèi)一直保持相對(duì)較高的表達(dá)水平,約為對(duì)照組的2.5—3.5倍,之后開(kāi)始下降,30d后GST表達(dá)量基本下降至對(duì)照組水平。Cd2+脅迫處理后,GST的表達(dá)值一直處于逐步上升狀態(tài),15d時(shí)達(dá)到最高,約為對(duì)照組的6.11倍,之后表達(dá)逐漸降低,至30 d時(shí)仍略高于(1.49倍)對(duì)照組。上述結(jié)果說(shuō)明,GST基因參與了重金屬的解毒過(guò)程,但是對(duì)于不同的重金屬解毒作用稍有不同。

3 討論

3.1 厚殼貽貝GST基因的序列分析

目前已發(fā)現(xiàn)的谷胱甘肽 S轉(zhuǎn)移酶亞型至少有 14種(Wanet al,2008;Umasuthanet al,2012),分別為alpha(α)、beta(β)、delta(δ)、epsilon(ε)、zeta(ζ)、theta(θ)、kappa(κ)、lambda(λ)、mu(μ)、pi(π)、sigma(σ)、tau(τ)、phi(φ)和omega(?)。這些亞型的分類(lèi)基于對(duì)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因N端結(jié)構(gòu)域的氨基酸、結(jié)構(gòu)、抗體反應(yīng)以及對(duì)抑制劑的敏感性(Kimet al,2009)。本次實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增得到厚殼貽貝GST序列經(jīng)測(cè)序和Blastn比對(duì)初步判定為pi型,在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中與雙殼貝類(lèi)pi型GST位于同一進(jìn)化支,與人、猴、鼠等進(jìn)化上差別較大。此外,上述各種GST亞型之間相互成簇,各聚成一支,該結(jié)果與周向紅等(2011)對(duì)條斑紫菜 GST基因的分析類(lèi)似。有學(xué)者(林群等,2009)提出,各種GST基因最終匯聚成同一樹(shù)根,可能是由于它們?cè)谄鹪瓷暇哂邢嗤淖嫦?由同一的GST基因發(fā)展變化而來(lái)。

pi型是眾多 GST亞型的典型代表,廣泛參與免疫細(xì)胞中毒素的代謝和親脂性化合物及其衍生物的產(chǎn)生過(guò)程(Kimet al,2009),因其具有抗氧化活性,并參與機(jī)體免疫防御,常被用作環(huán)境污染的指示標(biāo)記物,其表達(dá)水平在一定程度上可以有效地反應(yīng)生物體受環(huán)境毒物的損害程度,該特征在海洋雙殼貝類(lèi)中表現(xiàn)明顯,已獲得的海洋貝類(lèi)中的 GST基本屬于pi型(Yanget al,2004;Rheeet al,2007)。本研究已從厚殼貽貝中克隆出的該條基因核心序列,還有待于通過(guò)擴(kuò)增基因全長(zhǎng)確定其結(jié)構(gòu)特征,并找到調(diào)控位點(diǎn),為進(jìn)一步利用該基因評(píng)估厚殼貽貝等海洋經(jīng)濟(jì)貝類(lèi)的養(yǎng)殖水體污染狀況奠定基礎(chǔ)。

圖2 厚殼貽貝GST基因與其他GST亞型之間的進(jìn)化分析Fig.2 The relationship of M.coruscus GST-pi and other GST in phylogenetic tree

圖3 重金屬脅迫下厚殼貽貝pi型GST基因的表達(dá)分析Fig.3 Expression analysis of GST-pi from M.coruscus under stress of heavy metals

3.2 重金屬脅迫下厚殼貽貝GST基因的表達(dá)分析

通過(guò)相對(duì)定量表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),銅和鎘脅迫均能促使厚殼貽貝 GST基因表達(dá)升高,且表現(xiàn)為時(shí)間依賴(lài)型,該結(jié)果說(shuō)明厚殼貽貝對(duì)重金屬刺激較為敏感,可以通過(guò)自身的代謝調(diào)控作用排出毒素,GST基因在該免疫過(guò)程中發(fā)揮了重要作用,參與重金屬的解毒過(guò)程,周向紅等(2011)用不同濃度重金屬(鉛)刺激條斑紫菜,其 GST表達(dá)出現(xiàn)類(lèi)似的結(jié)果。有研究證實(shí),GST參與重金屬解毒的過(guò)程主要通過(guò)兩種方式:一是 GST基因能夠催化還原型谷胱甘肽直接與重金屬離子共價(jià)結(jié)合,從而降低重金屬離子毒性并促進(jìn)重金屬向液泡或質(zhì)外體轉(zhuǎn)運(yùn)(Adamiset al,2009);二是GST的過(guò)氧化物酶活性能利用還原型谷胱甘肽向氫過(guò)氧化物發(fā)動(dòng)親核攻擊,使其還原為低毒的一元醇(monohydroxy alcohol),從而緩解重金屬脅迫產(chǎn)生的氧化脅迫(Edwardset al,2000)。

此外,銅和鎘脅迫后 GST基因的表達(dá)特征略有不同,其中Cu2+刺激10d時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高,為對(duì)照組6.95倍,Cd2+刺激15d時(shí)表達(dá)量最高(6.11倍),隨后都開(kāi)始下降,但 Cd2+刺激后的表達(dá)量下降較為緩慢,至30d時(shí)仍有較高的表達(dá)(約為對(duì)照組的1.49倍)。上述表達(dá)特征可能是由于 GST對(duì)不同重金屬的解毒能力有所不同。另外,海洋貝類(lèi)中的 GST雖然主要為pi型,但仍有其他類(lèi)型GST的存在,生物表現(xiàn)出的解毒作用亦是不同類(lèi)型GST綜合作用的結(jié)果,Boutet等(2004)研究太平洋牡蠣受到碳?xì)浠衔锖娃r(nóng)藥的污染后GST的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)體內(nèi)各種亞型的GST表達(dá)量都有明顯的變化,且與毒素類(lèi)型以及濃度有關(guān),與環(huán)境因子和個(gè)性特征無(wú)關(guān)。本研究還有待于進(jìn)一步檢測(cè)不同濃度重金屬刺激作用下 GST的表達(dá)量,以確定生物的耐受程度,從而利用基因的表達(dá)情況指示水環(huán)境中重金屬的污染狀況。

3.3 厚殼貽貝GST分子對(duì)環(huán)境污染的指示功能

環(huán)境污染物是引發(fā)經(jīng)濟(jì)貝類(lèi)發(fā)生死亡的重要原因,至今已報(bào)道的環(huán)境污染物有重金屬、殺蟲(chóng)劑、有機(jī)污染物、工業(yè)廢水和環(huán)境內(nèi)分泌干擾物等,上述毒物進(jìn)入細(xì)胞后,大量的等活性氧分子立即在細(xì)胞中產(chǎn)生,這些活性氧分子不但直接對(duì)細(xì)胞造成損傷,還將大量脂質(zhì)分子氧化成為過(guò)氧化脂質(zhì),細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)與功能會(huì)受到過(guò)氧化脂質(zhì)的影響,機(jī)體正常的生命活動(dòng)受到危害(梁旭方,2006)。GST分子具有細(xì)胞解毒和抗氧化雙重功效,當(dāng)環(huán)境污染物對(duì)貝類(lèi)產(chǎn)生刺激時(shí),其機(jī)體內(nèi)的 GST活性顯著升高(Blanchetteet al,2002),并通過(guò)催化過(guò)氧化氫的氧化還原反應(yīng),清除體內(nèi)由代謝反應(yīng)產(chǎn)生的氧自由基和過(guò)氧化物,保護(hù)細(xì)胞免受外界脅迫環(huán)境損傷(張永國(guó)等,2006),基于此敏感反應(yīng),GST可作為環(huán)境污染指示分子(Lenartovaet al,2000),并有研究證實(shí)GST活性與污染物水平顯著相關(guān),可直觀反映環(huán)境的污染狀況(Martinez-Laraet al,1996)。在環(huán)境污染的評(píng)估和監(jiān)測(cè)方面,貝類(lèi)的pi型GST的作用尤為突出(Rheeet al,2007),Blanchette等(2003)對(duì)北方圓蛤pi型GST的研究是最早報(bào)道的海洋雙殼貝類(lèi) pi型 GST,結(jié)果指出pi型GST具有很強(qiáng)的解毒作用,從而使北方圓蛤能生活在污染嚴(yán)重的水體中,菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)的pi型GST亦是鎘等污染物的良好指示分子(Wanget al,2011);Feng等(2009)對(duì)硬殼蛤pi型GST研究發(fā)現(xiàn),該基因沒(méi)有內(nèi)含子,且這種無(wú)內(nèi)含子的GST要比有內(nèi)含子的GST解毒效果更明顯,而高速游動(dòng)的烏賊、斑馬魚(yú)等水生生物GST均有內(nèi)含子,說(shuō)明活動(dòng)性差的貝類(lèi) GST解毒效果更強(qiáng),可成為很好的環(huán)境污染指示物。

厚殼貽貝作為典型的營(yíng)附著生活的雙殼貝類(lèi),對(duì)環(huán)境污染具有很強(qiáng)的耐受性,是最常見(jiàn)的指示水體持久性污染的生物指示劑(Hoarauet al,2004)。本研究中,在銅和鎘持續(xù)脅迫下,厚殼貽貝GST基因的表達(dá)呈明顯上升狀態(tài),說(shuō)明 GST參與該生物的解毒過(guò)程,可以指示水環(huán)境中重金屬的污染狀況。Boutet(2004)曾指出pi型GST是農(nóng)藥污染監(jiān)測(cè)的有效標(biāo)記物,而重金屬是農(nóng)藥中的組成成分,本項(xiàng)研究結(jié)果可為重金屬污染的防治和檢測(cè)提供有效手段。因此,通過(guò)對(duì)厚殼貽貝等貝類(lèi)體內(nèi) GST表達(dá)水平進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),可加強(qiáng)對(duì)養(yǎng)殖水體中重金屬污染程度的檢測(cè),保證水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。

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