李 洋 劉 萍 李 健 李吉濤 馬 朋 高保全 段亞飛

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071;2.大連海洋大學(xué) 大連 116023;3.上海海洋大學(xué) 上海 201306)

脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)又名白蝦、小白蝦、五須蝦、青蝦等,隸屬于節(jié)肢動物門(Arthropoda)、甲殼綱(Curstacea)、十足目(Decapoda)、長臂蝦科(Palaemonidae)、白蝦屬(Exopalaemon),屬于熱溫帶海區(qū)底棲蝦類,尤以黃、渤海產(chǎn)量最高(劉瑞玉,1955)。因脊尾白蝦具有生長快、繁殖強和適應(yīng)性廣等優(yōu)點,隨著沿海灘涂的開發(fā)利用,特別是近年來脊尾白蝦養(yǎng)殖面積不斷擴大,已成為池塘單養(yǎng)、魚蝦貝類混養(yǎng)和蝦池秋冬季養(yǎng)殖的重要品種(王興強等,2005)。

酚氧化酶(penoloxidase,PO)是一種廣泛分布于動植物、微生物中含有銅離子結(jié)合位點的氧化酶,在分子氧作用下將酚類氧化成鄰苯醌,醌類可抑制微生物的感染并參與到宿主的防御反應(yīng)中(白霜等,2008)。而酚氧化酶一般情況下以無活性的酶原形式—酚氧化酶原(prophenoloxidase,proPO)存在,proPO通過酚氧化酶級聯(lián)反應(yīng)轉(zhuǎn)化成具有活性的 PO(Nappiet al,2005)。酚氧化酶原激活系統(tǒng)由proPO、PO、絲氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶抑制劑以及一些模式識別蛋白所構(gòu)成,在整個非特異性免疫機制中起到非常重要的作用并發(fā)揮多種功能(Cereniuset al,2004)。目前為止,proPO基因已經(jīng)從羅氏沼蝦Macrobarchium rosenbergii(DQ182596)、斑節(jié)對蝦Penaeus monodon(AF521948)、中國對蝦Fenneropenaeus chinensis(EU 015060)、凡納對蝦Litopenaeus vannamei(AY723296)、日本對蝦Marsupenaeus japonicus(AB065371,AB073223)、短鉤對蝦Penaeus semisculcatus(AF521949)、美國龍蝦Homarus americanus(AY655139)、歐洲龍蝦Homarus gammarus(AJ581662)等蝦類動物上克隆得到,所有的 proPOs均包含兩個銅離子結(jié)合位點,一段保守的區(qū)域和一個蛋白水解激活位點,但是均缺乏信號肽。但是關(guān)于脊尾白蝦proPO基因的研究還未見報道。

大量研究表明,養(yǎng)殖環(huán)境變化尤其是鹽度突變會削弱水產(chǎn)動物的免疫系統(tǒng)中酚氧化酶的活性(Vargas-Alboreset al,1998;Danielet al,2006;Bindhuet al,2007;Liet al,2010)。近年來脊尾白蝦的低鹽馴化和養(yǎng)殖已經(jīng)廣泛開展,而鹽度變化對脊尾白蝦免疫功能的影響機理尚不清楚。因此,本研究克隆了脊尾白蝦酚氧化酶原基因,利用熒光定量 PCR方法分析其組織表達分布,并分析了鹽度變化對酚氧化酶原基因表達的影響,以期為脊尾白蝦健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用脊尾白蝦來自昌邑海豐水產(chǎn)養(yǎng)殖有限責(zé)任公司,選取體長在(4.50±0.50)cm的健康活蝦,實驗前于200L的PVC桶中暫養(yǎng)一周時間,水溫21°C,鹽度32,pH8.0,連續(xù)充氣,早晚各投喂混合餌料一次。

鹽度脅迫實驗

設(shè)置鹽度梯度為 4、11、18、25、32、39、46;取樣時間設(shè)定為 0、2、4、8、16、24、32、48、72h。每個梯度設(shè)置3個平行,每桶135只脊尾白蝦,取樣時每個時間點每個平行組取15只蝦進行血淋巴和鰓組織樣品采集,每 5只蝦的樣品合并到一個采樣管中。鰓組織樣品取完后立刻放入液氮罐中,血液樣品800g 4°C離心10min取血細胞加入Trizol(Invitrogen)后放入液氮罐中保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 脊尾白蝦總RNA提取及cDNA的合成 采集脊尾白蝦不同組織樣品,液氮研磨,每 50mg組織中加1ml Trizol,提取總RNA,所得總RNA使用紫外分光光度計定量檢測,用 1.5%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)其完整性,保證所提總 RNA質(zhì)量高,可以滿足后續(xù)實驗要求。用RQ1 RNase-free DNase(Promega)消化總RNA樣品中殘留的DNA。脊尾白蝦cDNA合成體系(25μL)為:1μL(1μg/μL)消化處理后的RNA,Oligo d(T)2.5μL,H2O 5μL,72°C 水浴 5min,–80°C 冰浴 2min,5μL 5×緩沖液,1.25μL dNTP(10mmol/L),0.625μL RNase抑制劑,1.25μL M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶,DEPC(焦碳酸二乙酯)水4.375μL。輕輕混勻,離心,42°C保溫1h,70°C保溫15min。所得產(chǎn)物–20°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 脊尾白蝦酚氧化酶原基因 cDNA片段的克隆參照 GenBank上已公布的酚氧化酶原基因序列:日本囊對蝦(Marsupenaeus japonicus)(AB073223)、中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)(EF493829)、美洲螯龍蝦(Homarus americanus)(AY655139)以及龍蝦(Homarus gammarus)(AJ581662),采用 Clustalx軟件進行對比,進行兼并引物設(shè)計proPOF、proPOR(見表1),引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 實驗中所用的引物序列Tab.1 Primer sequences used in this study

以脊尾白蝦血細胞cDNA為模板進行擴增,其反應(yīng)體系如下(25μL):cDNA 1μL,10×緩沖液 2.5μL,MgCl21.5μL,dNTP 0.5μL,proPOF 2.5μL,proPOR 2.5μL,Taq DNA 聚合酶 0.25μL。反應(yīng)程序:95°C 變性5min,1個循環(huán);94°C變性30s,55°C退火30s,72°C延伸30s,28個循環(huán);72°C延伸10min,1個循環(huán);4°C保存。所得 PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證擴增結(jié)果及片段大小,使用 DNA膠回收試劑盒進行膠回收純化,與 pMD18-T載體進行連接,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至 Top10感受態(tài)細胞,挑選陽性克隆經(jīng) PCR驗證由生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.3 proPO 基因的 3′RACE 和 5′RACE 擴增 以測序所得proPO基因片段為模板設(shè)計3′和5′RACE所需引物 proPO 3′race1、proPO 3′race2、proPO 5′race1、proPO 5′race2(見表1),使用 SMARTTMRACE 試劑盒說明進行3′和5′RACE擴增,反應(yīng)條件如下:94°C變性5min,1個循環(huán);94°C變性30s,72°C延伸3min,5個循環(huán);94°C變性30s,70°C退火30s,72°C延伸3min,5個循環(huán);94°C變性 30s,68°C退火 30s,72°C延伸3min,25個循環(huán);72°C延伸10min,1個循環(huán);4°C保存。擴增產(chǎn)物回收純化,克隆、測序。

1.2.4 序列拼接與生物信息學(xué)分析 測序結(jié)果使用NCBI網(wǎng)站提供的VecScreen工具進行載體去除與序列拼接(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/VecScreen.html),拼接所得序列使用 NCBI提供的BLAST程序進行比對(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/),利用 DNAMAN 軟件進行蛋白質(zhì)的翻譯,利用EditSeq程序進行開放閱讀框的預(yù)測。利用SMART和 Interpro Scan軟件進行蛋白質(zhì)功能域及結(jié)構(gòu)域的預(yù)測與分析,分別利用Clustalx和MEGA進行多重序列比對和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建。

1.2.5 熒光定量PCR方法分析proPO組織表達和鹽度脅迫后的表達變化 提取脊尾白蝦血細胞、鰓、肝胰腺和肌肉中的總 RNA,分別合成 cDNA,以 proPO基因的 cDNA序列為模板,設(shè)計引物 proPO HF和proPO HR(見表1),根據(jù)已公布的脊尾白蝦線粒體RNA設(shè)計一對內(nèi)參引物18S HF和18S HR(見表1)利用定量RT-PCR方法進行組織表達檢測。RT-PCR擴增體系(20μL)為:SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(2×),10μL;PCR Forward Primer(10μmol/L),0.8μL;PCR Reverse Primer(10μmol/L),0.8μl;ROX Reference Dye Ⅱ(50×)*3,0.4μL;DNA 模板,0.6μL;dH2O,7.4μL。反應(yīng)程序為:95°C 30s;95°C 5s,60°C 34s,40 個循環(huán);95°C 15s,60°C 1min,95°C 15s。每份樣品做 3 組平行,結(jié)果采用2–△△Ct法進行分析。以不同鹽度處理組的脊尾白蝦血淋巴和鰓總 RNA為模板,合成 cDNA,利用RT-PCR方法進行proPO在鹽度脅迫下表達變化特征的檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 脊尾白蝦proPO基因cDNA全長的克隆與序列分析

所提總RNA質(zhì)量較高(圖1a),以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板,擴增獲得長約400bp的中間片段(圖1b)。利用3′和5′RACE分別獲得一條長約1500bp和1200bp的特異性條帶(圖1c)。

圖1 脊尾白蝦電泳圖譜Fig.1 The electrophoretogram of E.carinicauda

脊尾白蝦proPO基因cDNA全長3092 bp。利用EditSeq程序分析,其開放閱讀框(ORF)為2013bp,編碼671個蛋白質(zhì),其5′端和3′端各包含64bp和1015bp的非編碼區(qū),且包括1個polyA尾結(jié)構(gòu)、1個加尾信號AATAAA結(jié)構(gòu)和與Cu結(jié)合的氨基酸殘基特征序列(圖2)。該基因所編碼的蛋白推導(dǎo)分子量為 74.82kDa,理論等電點為6.23。使用SMART工具進行分析,脊尾白蝦酚氧化酶原基因蛋白含有 3個串聯(lián)的血藍蛋白結(jié)構(gòu)域分別為 Hemocyanin-N 結(jié)構(gòu)域(43—120)、Hemocyanin-M結(jié)構(gòu)域(124—396)和Hemocyanin-C結(jié)構(gòu)域(402—666)(圖3)。脊尾白蝦 proPO 基因 cDNA序列已提交GenBank(登錄號:JQ812983)。

2.2 同源序列比對及構(gòu)建系統(tǒng)進化樹

通過NCBI網(wǎng)站提供Blast軟件對編碼甲殼動物酚氧化酶原基因的氨基酸序列進行比對(圖4),該序列與羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenberqii,DQ182596)同源性為 78%、與凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei,EF565469)同源性為 66%、與斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon,AF521948)、中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis,EU015060)、南美短溝白對蝦(Penaeus semisulcatus,AF521949)的同源性均為65%。利用MEGA4.0軟件對所比對的proPO氨基酸序列進行系統(tǒng)樹構(gòu)建如圖5,其中脊尾白蝦與羅氏沼蝦、中華絨螯蟹聚為一個亞群,中國對蝦、凡納濱對蝦、斑節(jié)對蝦等聚為一個亞群,表明酚氧化酶原基因在進化過程中具有較高的保守性。

2.3 脊尾白蝦proPO基因在各組織中的表達分布

利用RT-PCR技術(shù)對脊尾白蝦各組織中porPO的表達量進行分析(圖6),proPO的表達量在血淋巴中最高,其次為鰓和肝胰腺,在肌肉中的表達量最低。

2.4 脊尾白蝦鹽度脅迫后血淋巴和肝胰腺proPO表達變化情況

不同鹽度脅迫后各組織 proPO的變化特征如圖7,在血細胞中,proPO表達量隨著鹽度脅迫時間的延長逐漸升高,至24h時各處理組proPO基因表達量均達到最高,且與對照組 proPO基因表達量差異顯著(P<0.05),脅迫48h后對照組與各處理組proPO基因表達量差異不顯著(P>0.05),趨于穩(wěn)定。

鹽度脅迫后proPO基因在鰓中的表達變化如圖8所示,低鹽度處理組(鹽度 4、11、18、25)在脅迫后2h proPO基因表達量達到最高,且與對照組和高鹽度處理組 proPO基因表達量差異顯著(P<0.05),隨后逐漸下降;而高鹽度處理組(鹽度39、46)在脅迫后8h和24h proPO基因表達量出現(xiàn)2次波動,且與對照組差異顯著(P<0.05),隨后各處理組 proPO基因表達量逐漸恢復(fù)至正常水平。

3 討論

圖2 脊尾白蝦proPO基因的cDNA核苷酸序列及其預(yù)測的氨基酸序列Fig.2 cDNA sequence and deduced amino acid sequence of prophenoloxidase gene in E.carinicauda

圖3 脊尾白蝦酚氧化酶原中三個血藍蛋白結(jié)構(gòu)域Fig.3 Distribution of three tandem hemocyan in domains of proPO from E.carinicauda

圖4 脊尾白蝦proPO氨基酸序列與其他物種proPOs氨基酸序列比較Fig.4 Amino-acid sequence alignment of E.carinicauda proPO with different animals propos

圖5 利用MEGA4軟件NJ法構(gòu)建的proPO系統(tǒng)進化樹Fig.5 NJ tree based on proPO amino acid sequences using MEGA 4

甲殼動物酚氧化酶在免疫反應(yīng)時通過黑化作用的形式參與宿主的防御反應(yīng)(Ashidaet al,1990)。酚氧化酶一般情況下以無活性的酶原形式存在即酚氧化酶原proPO,proPO通過酚氧化酶級聯(lián)反應(yīng)轉(zhuǎn)化成具有活性的 PO,酚氧化酶原激活系統(tǒng)在非特異性免疫系統(tǒng)中起著非常重要的作用(Soderhallet al,1998)。近年來,人們認(rèn)識到酚氧化酶原激活系統(tǒng)在環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)中也具有重要的作用,對于酚氧化酶原基因的克隆及表達方面進行了大量的研究。三疣梭子蟹Portunus trituberculatus、中華絨螯蟹Eriocheir sinensis、鋸緣青蟹Scylla serrata、短溝對蝦P.semisculcatus、羅氏沼蝦M.rosenbergii、日本對蝦M.japonicus等甲殼動物酚氧化酶原基因已經(jīng)被克隆得到(葉星等,2003;Liuet al,2006;Koet al,2007;Gaiet al,2008;Chenet al,2010;孫杰等,2010)。本研究通過同源克隆方法得到脊尾白蝦酚氧化酶原基因的全序列,該基因cDNA全長為3092bp,開放閱讀框為2013bp長,編碼671個氨基酸,其預(yù)測分子量為74.82kDa,甲殼動物酚氧化酶是一種含雙銅的氧化還原酶,其分子量在70kDa左右(汪小峰等,2003)。通過氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)其與羅氏沼蝦M.rosenberqii的同源性最高達到78%;另外發(fā)現(xiàn)脊尾白蝦proPO cDNA序列中含有 3個串聯(lián)的血藍蛋白特征結(jié)構(gòu)域分別為Hemocyanin-N 結(jié)構(gòu)域(殘基 43—120)、Hemocyanin-M結(jié)構(gòu)域(殘基 124—396)、Hemocyanin-C結(jié)構(gòu)域(殘基402—666),而且與其他甲殼動物酚氧化酶原保守血藍蛋白結(jié)構(gòu)域之間的相似性很高,證明甲殼動物的proPO基因也是血藍蛋白基因家族的一員。利用RT-PCR技術(shù)分析了脊尾白蝦proPO基因在4種組織中的表達分布,結(jié)果發(fā)現(xiàn)proPO基因在血細胞中的表達量是最高的,在肌肉中的表達量最低,這與斑節(jié)對蝦(Pitiet al,2009)和中國對蝦(孫杰等,2010)的研究結(jié)果相一致。

圖6 脊尾白蝦proPO在不同組織中的表達Fig.6 Real time PCR analysis of proPO gene expression from different tissues of E.carinicauda

圖7 鹽度脅迫后proPO基因在血細胞中的表達變化Fig.7 The expression of proPO in haemocytes after salinity stress

圖8 鹽度脅迫后proPO基因在鰓組織中的表達變化Fig.8 The expression of proPO in gills after salinity stress

集約化養(yǎng)殖中的蝦類面臨著各種環(huán)境應(yīng)激,環(huán)境因子(溫度、鹽度、溶解氧、pH和氨氮等)的改變都可引發(fā)蝦機體的應(yīng)激反應(yīng),這雖是一種保護性反應(yīng),但若長期處于應(yīng)激狀態(tài)下,蝦機體的免疫功能會受到抑制,容易誘發(fā)疾病甚至死亡。為了了解養(yǎng)殖過程中的環(huán)境因子突變帶來的潛在性危害,必須進一步探討蝦免疫和環(huán)境脅迫之間的相互關(guān)系。已有研究表明,鹽度變化能夠影響血淋巴 proPO的活性(Vargas- Alboreset al,1998)。鹽度從20升至45會顯著削弱波紋龍蝦Panulirus homarusPO的活性(Bindhuet al,2007);而低鹽度脅迫會降低悉尼巖石牡蠣Saccostrea glomerataPO的活性(Danielet al,2006)。本研究在不同鹽度不同時間的脅迫作用下,脊尾白蝦proPO基因在血細胞和鰓組織中的表達變化呈現(xiàn)在 24—48h呈現(xiàn)波動的趨勢,特別是當(dāng)脅迫24h時在血細胞中的表達量達到峰值;當(dāng)脅迫48h后達到穩(wěn)定,此時低鹽度組的表達量仍然高于正常鹽度和高鹽度組的表達值,這與凡納濱對蝦的研究結(jié)果相似(Liet al,2010),上述結(jié)果說明,低鹽馴化時,鹽度降低對于脊尾白蝦proPO基因的表達具有一定的促進作用,這有助于其酚氧化酶原激活系統(tǒng)更好地發(fā)揮作用,推測低鹽馴化過程中鹽度降低對于脊尾白蝦的免疫調(diào)控機制會起到一定的促進作用,有助于其抗應(yīng)激能力的提高,具體的影響方式與機理還有待進一步深入研究。

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