張 丹，王錫昌*

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306）

中華鱉腿肉蛋白質(zhì)體內(nèi)外消化研究

張 丹，王錫昌*

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306）

通過(guò)測(cè)定氨基酸組成、體內(nèi)外蛋白質(zhì)消化率及經(jīng)蛋白質(zhì)消化率校正的氨基酸評(píng)分（protein digestibilitycorrected amino acid scores，PDCAAS）等指標(biāo)，評(píng)價(jià)熱處理前后中華鱉腿肉蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。結(jié)果表明：中華鱉腿肉熱處理前后必需氨基酸含量分別為36.84%、34.55%（以干質(zhì)量計(jì)），占氨基酸總量的41.12%、40.20%，其構(gòu)成符合聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織推薦的理想模式。熱處理前，測(cè)得中華鱉腿肉蛋白質(zhì)體外消化率為83.68%，體內(nèi)消化率為95.05%；熱處理后，測(cè)得其體外消化率為87.04%，體內(nèi)消化率為96.18%，熱處理后消化率顯著提高（P＜0.05）。結(jié)合氨基酸評(píng)分及真實(shí)消化率，計(jì)算得到熱處理前其PDCAAS為100%，由于蒸煮過(guò)程營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的流失，測(cè)得熱處理后Trp氨基酸評(píng)分最低為80，熱處理后其PDCAAS為76.94%。

中華鱉；體內(nèi)消化；體外消化；經(jīng)蛋白質(zhì)消化率校正的氨基酸評(píng)分

中華鱉（Trionyx sinensis），俗稱(chēng)甲魚(yú)、團(tuán)魚(yú)等，是我國(guó)特色水產(chǎn)品。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織漁業(yè)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，2012年全球中華鱉養(yǎng)殖產(chǎn)量已達(dá)到33.6萬(wàn) t，其中98.77%產(chǎn)自中國(guó)[1]。中華鱉腿肉蛋白質(zhì)含量高達(dá)18.20%[2]，是人體攝取蛋白質(zhì)的良好來(lái)源。蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，一方面取決于其含量，另一方面在很大程度上取決于其氨基酸組成及消化率。蛋白質(zhì)消化率反映了蛋白質(zhì)在消化道內(nèi)被分解的程度，消化率越高，則被機(jī)體利用的可能性越大，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值越大[3]。目前消化率的研究主要包括體外消化實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)消化實(shí)驗(yàn)兩種方法[4]。1991年聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（The Food and Agriculture Organization of United States，F(xiàn)AO）/世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）蛋白質(zhì)品質(zhì)評(píng)價(jià)專(zhuān)家委員會(huì)公布并推薦通過(guò)蛋白質(zhì)消化率校正的氨基酸評(píng)分（protein digestibility-corrected amino acid scores，PDCAAS）這一指標(biāo)來(lái)衡量蛋白質(zhì)質(zhì)量[5]。PDCAAS綜合考慮氨基酸評(píng)分及真實(shí)消化率，能較好地評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)品質(zhì)，為測(cè)定蛋白質(zhì)品質(zhì)的首選方法[6-7]。

前人關(guān)于中華鱉蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的研究，主要從蛋白質(zhì)含量、蛋白質(zhì)組成、氨基酸組成及功能性蛋白方面進(jìn)行[2,8-9]。對(duì)于中華鱉蛋白質(zhì)的消化率及通過(guò)真實(shí)消化率來(lái)計(jì)算的PDCAAC尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)從體外、體內(nèi)消化實(shí)驗(yàn)及PDCAAS的角度，分析評(píng)價(jià)熱處理前后中華鱉腿肉的蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)特性，一方面對(duì)熱處理對(duì)蛋白質(zhì)品質(zhì)的影響進(jìn)行初步探討，另一方面為中華鱉腿肉蛋白質(zhì)更全面的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中華鱉由上海尚達(dá)水產(chǎn)科技發(fā)展有限公司提供，體質(zhì)量為550～750 g，樣品數(shù)量20 只。飼料由南通特洛菲飼料科技有限公司按照美國(guó)AIN-93標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)。實(shí)驗(yàn)大鼠由上海湯寶生物科技服務(wù)社提供，清潔級(jí)，雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體質(zhì)量為50～70 g。

胃蛋白酶（P7000）、胰酶（V900486） 美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Kieltel 8400凱氏定氮儀 丹麥福斯公司；L-8800氨基酸自動(dòng)分析儀 日本日立公司；970CRT熒光分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

將鮮活的中華鱉宰殺，取腿部肌肉攪碎后分成3 部分。一部分直接分裝，于-20 ℃條件下保存；一部分進(jìn)行冷凍干燥處理，得到生中華鱉粉；最后一部分進(jìn)行蒸煮處理（溫度100 ℃、時(shí)間15 min、料液比1∶1.5）后，再進(jìn)行冷凍干燥獲得熟中華鱉粉。

1.3.2 飼料加工

飼料配方如表1所示。

表1 蛋白質(zhì)體內(nèi)消化實(shí)驗(yàn)飼料配方Table1 Feed formulations used for in vivo protein digestion trials g/100 g

1.3.3 氨基酸組成的測(cè)定

使用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定除色氨酸外的17 種氨基酸含量[10]，色氨酸含量采用熒光分光光度法[11]測(cè)定。

1.3.4 蛋白質(zhì)體外消化實(shí)驗(yàn)

參照Akeson等[12]建立的胃蛋白酶-胰酶體外消化模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并略作修改。

1.3.4.1 模擬胃液（simulated gastric fluid，SGF）消化實(shí)驗(yàn)

稱(chēng)取0.5 g攪拌均勻的腿肉于三角燒瓶中，添加15 mL模擬胃液（0.1 g胃蛋白酶溶于1 L 0.1 mol/L鹽酸，pH 1.5），在恒溫振蕩水浴鍋中37 ℃水浴3 h進(jìn)行消化。1.3.4.2 模擬腸液（simulated intestinal fl uid，SIF）消化實(shí)驗(yàn)

用0.2 mol/L的NaOH將1.3.4.1節(jié)消化液pH值調(diào)整到8.0。之后在反應(yīng)體系中加入7.5 mL含有0.005 mol/L NaN3的模擬腸液（0.533 g胰酶溶于1 L pH 8.0的磷酸鹽緩沖液），繼續(xù)在恒溫振蕩器水浴鍋中37 ℃水浴加熱24 h。

模擬腸液消化實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，向反應(yīng)體系中添加10 mL 20%的三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）終止反應(yīng)。

1.3.4.3 體外蛋白質(zhì)消化率計(jì)算

模擬胃液消化率（protein digestibility in gastric fl uid，PDG）、模擬腸液消化率（protein digestibility in intestinal fluid，PDI）及總消化率（total protein digestibility，PDT）按照公式（1）～（3）進(jìn)行計(jì)算。

式中：P0為樣品中的蛋白質(zhì)含量/（g/100 g）；P1為模擬胃液消化后剩余蛋白質(zhì)含量/（g/100 g）；P2為模擬腸液消化后剩余蛋白質(zhì)含量/（g/100 g）。

1.3.5 蛋白質(zhì)體內(nèi)消化實(shí)驗(yàn)

1.3.5.1 體內(nèi)消化實(shí)驗(yàn)

參照AOAC 991.29《True Protein Digestibility of Foods and Food Ingredients》及Wong等[13]的方法，采用大鼠糞氮平衡實(shí)驗(yàn)進(jìn)行蛋白質(zhì)體內(nèi)消化研究。實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)SD大鼠2 d后，隨機(jī)分成4 組：標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白組、無(wú)氮飼料組、生中華鱉粉組及熟中華鱉粉組。其中酪蛋白飼料（蛋白質(zhì)含量10%）為對(duì)照組，無(wú)氮飼料為空白組，生中華鱉粉及熟中華鱉粉飼料（蛋白質(zhì)含量10%）為實(shí)驗(yàn)組。每組8只，每只大鼠在代謝籠中單籠飼養(yǎng)。飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)分為4 d的預(yù)備期和5 d的平衡期。在5 d的平衡期中，每天收集未攝食的飼料殘?jiān)袄鲜蠹S便、尿液，并分裝在不同的容器中。飼料殘?jiān)占箫L(fēng)干3 d，之后進(jìn)行稱(chēng)質(zhì)量。大鼠糞便及殘?jiān)?jīng)100 ℃干燥、稱(chēng)質(zhì)量、研磨后進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程，保證大鼠自由飲水，限制每只大鼠攝食量為15 g/d。

1.3.5.2 評(píng)價(jià)指標(biāo)計(jì)算

蛋白質(zhì)真實(shí)消化率（true digestibility，TD）、生物價(jià)（biological value，BV）、凈蛋白利用率（net protein utilization，NPU）以及蛋白質(zhì)消化率校正的氨基酸評(píng)分分別根據(jù)公式（4）～（7）計(jì)算[14]。

式中：Ni為攝入氮含量/（mg/d）；Fn為糞氮含量/（mg/d）；Fk為糞代謝氮含量/（mg/d）；Un為尿氮含量/（mg/d）；Uk為尿內(nèi)源氮含量/（mg/d）；LAAS為最低限制性氨基酸評(píng)分（limiting amino acids score）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0進(jìn)行單因素方差顯著性分析，統(tǒng)計(jì)值用±s表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸組成分析

表2 熱處理前后中華鱉腿肉的氨基酸組成（x±s，n＝3）Table2 Amino acid composition of Chinese soft-shelled turtle muscle protein (x±s,n= 3)

由表2可知，熱處理前后樣品中均檢測(cè)出18 種氨基酸，其中谷氨酸含量最高，分別為14.00%、13.21%。熱處理過(guò)程中由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流失到蒸煮液中，中華鱉腿肉氨基酸總量（total amino acids，TAA）、必需氨基酸總量（total essential amino acids，TEAA）均低于熱處理前的樣品。熱處理前后，兩者TEAA/TAA、TEAA/非必需氨基酸總量（total nonessential amino acids，TNEAA）均符合FAO/WHO推薦的TEAA/TAA為40%左右、TEAA/TNEAA在60%以上這一理想氨基酸組成模式[15]，為優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)來(lái)源。

表3 熱處理前后中華鱉腿肉必需氨基酸含量及其評(píng)分Table3 Contents and amino acid scores of essential amino acids in Chinese soft-shelled turtle meat

由表3可知，熱處理前后樣品必需氨基酸總量均高于FAO/WHO推薦的32.0[6]，但低于雞蛋中的49.0。根據(jù)氨基酸評(píng)分（amino acid scores，AAS），Trp的AAS在熱處理前、后的樣品中均表現(xiàn)最低，分別為115、80。熱處理前中華鱉腿肉必需氨基酸評(píng)分均高于100，與湯崢嶸等[16]的研究結(jié)果一致，氨基酸組成十分均衡，為優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)來(lái)源。

2.2 體外消化實(shí)驗(yàn)

表4 熱處理前后中華鱉腿肉蛋白質(zhì)體外消化率（x±s，n＝3）Table 4in vitro digestibility of Chinese soft-shelled turtle protein (x±s, n= 3) %

前期實(shí)驗(yàn)測(cè)得，熱處理前中華鱉腿肉蛋白質(zhì)含量為18.20%，熱處理后腿肉蛋白質(zhì)含量為24.36%[2]。由表4可知，經(jīng)過(guò)整個(gè)蛋白質(zhì)體外消化過(guò)程，熱處理前其腿肉蛋白質(zhì)消化率為83.68%，高于帶魚(yú)[17]的80.96%、牛肉[12]的80%等肉類(lèi)。在胃液中，胃蛋白酶能水解含芳香族氨基酸、蛋氨酸、亮氨酸等氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，把蛋白質(zhì)分解成多肽。但由于胃蛋白酶的消化作用較弱，食物在胃中停留時(shí)間較短，所有蛋白質(zhì)在胃中的消化很不完全。食糜進(jìn)入小腸后，蛋白質(zhì)的不完全水解產(chǎn)物會(huì)在腸液中進(jìn)一步被分解[18]。整個(gè)消化過(guò)程中，71.79%的蛋白質(zhì)在模擬胃液中被分解，在模擬腸液中有11.89%的蛋白質(zhì)及前者的不完全分解產(chǎn)物被進(jìn)一步消化。

對(duì)比熱處理前后中華鱉腿肉蛋白質(zhì)消化率，可以發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)熱處理后的PDG、PDI及PDT值均高于熱處理前，且PDG、PDT值差異顯著（P＜0.05），這個(gè)結(jié)論與Sun Minjie等[19]關(guān)于熱處理對(duì)蛋白質(zhì)消化率影響的研究結(jié)論類(lèi)似。消化率的提高可能是熱處理使蛋白質(zhì)發(fā)生了不同程度的變性，比如蛋白質(zhì)的伸展、重組，分子間氫鍵、二硫鍵部分?jǐn)嗔训龋罱K蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致其消化率發(fā)生變化[20]。

2.3 體內(nèi)消化實(shí)驗(yàn)

表5 體內(nèi)消化實(shí)驗(yàn)中大鼠的攝食及體質(zhì)量增加結(jié)果（x±s，n＝8）Table5 Food intake and weight gain in rats from in vivo digestion trials (x±s,n= 8) g/d

表5是酪蛋白組與實(shí)驗(yàn)組大鼠攝食量（Fi）、蛋白攝入量（Pi）及體質(zhì)量增量（weight gain，Wg）的結(jié)果，對(duì)照組（酪蛋白組）與實(shí)驗(yàn)組在攝食、蛋白攝入量、體質(zhì)量增量上沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）。理論上通過(guò)體內(nèi)消化實(shí)驗(yàn)評(píng)估蛋白質(zhì)品質(zhì)，如果實(shí)驗(yàn)組蛋白質(zhì)品質(zhì)低于酪蛋白組，動(dòng)物的攝食就會(huì)減少。如果實(shí)驗(yàn)組與酪蛋白組的攝食量出現(xiàn)顯著性差異，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)組攝入的蛋白質(zhì)部分用于能量及蛋白組織的合成，則實(shí)驗(yàn)結(jié)果將會(huì)受到影響[21]。

表6 熱處理前后中華鱉蛋白質(zhì)體內(nèi)消化實(shí)驗(yàn)營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)指標(biāo)（x±s，n＝8）Table6 Nutritional assessment indicators showing the in vivo digestibility of Chinese soft-shelled turtle protein (x±s,n= 8)

體外消化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說(shuō)明中華鱉腿肉蛋白質(zhì)具有較好的消化性，且經(jīng)過(guò)熱處理中華鱉腿肉蛋白質(zhì)的消化率呈現(xiàn)出顯著性提升。為此，實(shí)驗(yàn)又進(jìn)一步通過(guò)體內(nèi)消化實(shí)驗(yàn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表6所示。熱處理后中華鱉粉蛋白質(zhì)消化率為96.18%，顯著高于熱處理前的95.05%，與體內(nèi)消化率研究結(jié)果相同，進(jìn)一步驗(yàn)證了熱處理可以提高蛋白質(zhì)消化率這一結(jié)論。對(duì)比酪蛋白組消化率，熟中華鱉粉與酪蛋白之間的消化率差異不顯著，但兩者均顯著高于生中華鱉粉，說(shuō)明熱處理后的中華鱉腿肉蛋白質(zhì)品質(zhì)與酪蛋白相當(dāng)，但低于牛肉的98%[5]。蛋白質(zhì)生物價(jià)（BV）是反映食物蛋白質(zhì)消化吸收后被機(jī)體利用程度的指標(biāo)，BV值越高，說(shuō)明被機(jī)體利用程度較高。中華鱉腿肉熱處理前，其BV值為94.50%，略高于酪蛋白93.78%，差異不顯著，但明顯高于魚(yú)肉（83%）、牛肉（76%）、豬肉（74%）[3]等肉類(lèi)蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)凈利用率（NPU）在BV的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考慮了在消化過(guò)程中未吸收而丟失的氮，將生物價(jià)乘以消化率。熱處理前后中華鱉腿肉的NPU值與酪蛋白組均沒(méi)有顯著性差異。綜上所述，中華鱉腿肉的TD、BV、NPU 3 個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)均表明其蛋白質(zhì)具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，可作為優(yōu)質(zhì)蛋白的來(lái)源。2.4 蛋白質(zhì)消化率校正的氨基酸評(píng)分

PDCAAS是基于氨基酸組成與消化率的蛋白質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)，該指標(biāo)綜合考慮氨基酸評(píng)分及真實(shí)消化率，能較好的評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)品質(zhì)。PDCAAS最大為100%，當(dāng)PDCAAS大于100%時(shí)則認(rèn)定為100%，表示蛋白質(zhì)在消化后能夠提供給機(jī)體需求的100%氨基酸[6,22]。由表3的氨基酸評(píng)分及表6的TD值分析得出，熱處理前其PDCAAS為100%，熱處理后中華鱉腿肉PDCAAS為76.94%。熱處理前中華鱉腿肉蛋白質(zhì)的PDCAAS與乳清蛋白、酪蛋白、雞蛋蛋白、大豆蛋白等優(yōu)質(zhì)蛋白一致，高于牛肉92%[5]，表明其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，易于消化吸收[23]。

3 結(jié) 論

中華鱉腿肉氨基酸組成、體內(nèi)外消化實(shí)驗(yàn)及PDCAAS等研究結(jié)果均表明其蛋白質(zhì)為優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)來(lái)源。中華鱉腿肉各必需氨基酸評(píng)分均高于100，且其PDCAAS得分為100%。熱處理后的腿肉蛋白質(zhì)由于蒸煮過(guò)程，一部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流失到湯汁中，總氨基酸含量減少，PDCAAS得分為76.94%。雖然熱處理前后氨基酸組成發(fā)生了變化，但其TEAA/TAA、TEAA/TNEAA比值均符合FAO/WHO推薦的理想模式。

體外消化實(shí)驗(yàn)通過(guò)胃蛋白酶-胰酶消化模型模擬了食物在人體消化道內(nèi)的消化過(guò)程，實(shí)驗(yàn)先后測(cè)定熱處理前后中華鱉腿肉蛋白質(zhì)在模擬胃液、模擬腸液消化率及總消化率。結(jié)果表明，中華鱉腿肉消化率為83.68%，熱處理后其消化率顯著提高（87.04%）。體內(nèi)消化實(shí)驗(yàn)又通過(guò)大鼠糞氮平衡實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，熱處理后蛋白質(zhì)體內(nèi)消化率96.18%高于熱處理前蛋白質(zhì)消化率95.05%。體內(nèi)外消化消化實(shí)驗(yàn)表明熱處理能提高中華鱉腿肉蛋白質(zhì)消化率，更容易被人體消化吸收。

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Digestibility in vitro and in vivo of Chinese Soft-Shelled Turtle Protein

ZHANG Dan, WANG Xi-chang*
(College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

The nutritional value of Chinese soft-shelled turtle leg muscle protein before and after heat treatment was evaluated based on amino composition, in vitro and in vivo digestibility and protein digestibility-corrected amino acid score (PDCAAS). The results showed that the contents of essential amino acids were 36.84% and 34.55%, respectively before and after heat treatment. The ratios of total essential amino acids to total amino acids (TEAA/TAA) were 41.12% and 40.20%, respectively, meeting the FAO/WHO standard. The in vitro and in vivo digestibility of Chinese soft-shelled turtle protein were 83.68% and 95.05%, and increased to 87.04% and 96.18%, respectively after heat treatment. These results suggested that heat treatment signif i cantly increased the in vitro and in vivo digestibility (P ＜ 0.05). The PDCAAS of Chinese softshelled turtle, as calculated by multiplying the limiting amino acid score by protein digestibility, reduced from 100% to 76.94% due to the nutrient losses during cooking.

Chinese soft-shelled turtle; in vitro digestibility; in vivo digestibility; protein digestibility-corrected amino acid scores (PDCAAS)

TS254.1

A

1002-6630（2014）21-0113-05

10.7506/spkx1002-6630-201421022

2014-06-30

上海市科委工程中心建設(shè)項(xiàng)目（11DZ2280300）；上海市教委重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（J50704）；上海高校知識(shí)服務(wù)平臺(tái)《上海海洋大學(xué)水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心》項(xiàng)目（ZF1206）

張丹（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)與安全。E-mail：546392607@qq.com

*通信作者：王錫昌（1964—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)與安全。E-mail：xcwang@shou.edu.cn