朱 媛ZHU Yuan

段小藝1DUAN Xiaoyi

王瑞峰1WANG Ruifeng

樊鋼練2FAN Ganglian

郭佑民1GUO Youmin

乳腺癌HER2靶向分子探針的制備及體外MRI初步研究

朱 媛1ZHU Yuan

段小藝1DUAN Xiaoyi

王瑞峰1WANG Ruifeng

樊鋼練2FAN Ganglian

郭佑民1GUO Youmin

目的以乳腺癌表皮生長因子受體2（HER2）為靶點，制備以順磁性粒子釓為載體的MR分子探針，通過MR靶向成像為乳腺癌個體化治療提供影像學(xué)依據(jù)。材料與方法利用課題組前期制備的針對HER2的熒光標(biāo)記探針FITC-LTVSPWY與釓噴替酸葡甲胺（Gd-DTPA）耦聯(lián)獲得MR靶向探針。以表達HER2陽性的人乳腺癌細(xì)胞SKBR3、MCF-7及HER2陰性的MDA-MB-231細(xì)胞為觀察對象，加入靶向探針FITC-LTVSPWY-Gd-DTPA共同孵育作為實驗組，細(xì)胞加入Gd-DTPA作為對照組，不添加任何探針的細(xì)胞作為空白組，利用MRI行體外細(xì)胞成像；T1WI序列采集圖像，進行視覺分析與比較各組細(xì)胞MRI信號。結(jié)果細(xì)胞體外MRI結(jié)果顯示，實驗組細(xì)胞T1WI呈高信號，對照組與空白組細(xì)胞均呈等信號，且存在視覺差異。結(jié)論課題組構(gòu)建的以HER2為靶點的MR分子探針具有良好的磁學(xué)特性，體外可以與HER2陽性乳腺癌細(xì)胞特異性地結(jié)合，為體內(nèi)成像研究奠定了基礎(chǔ)。

乳腺腫瘤；靶向探針；釓；表皮生長因子受體；磁共振成像

分子成像在惡性腫瘤的個體化治療方面具有潛在的發(fā)展與應(yīng)用前景。人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2, HER2）在20%～30%的乳腺癌中呈過表達，其表達水平與患者的預(yù)后密切相關(guān)[1,2]。目前，曲妥珠單抗、拉帕替尼等[3,4]多種針對HER2的靶向治療藥物已經(jīng)應(yīng)用于臨床，并取得了良好的效果。腫瘤患者能否應(yīng)用靶向治療藥物、治療效果如何在很大程度上依賴于腫瘤組織HER2的表達與否及表達水平的高低[5-7]。因此，治療前與治療過程中監(jiān)測HER2在乳腺癌患者腫瘤組織中的表達水平對于合理制訂治療方案至關(guān)重要。本研究嘗試將臨床最常用的MR陽性對比劑釓噴替酸葡甲胺（Gd-DTPA）與針對HER2的寡肽分子LTVSPWY耦聯(lián)制備MRI靶向探針，檢測此探針的物理與磁學(xué)特性，通過體外細(xì)胞成像觀察探針的靶向性，為MRI靶向成像的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Gd-DTPA為愛爾蘭Amersham Health公司產(chǎn)品，熒光素標(biāo)記的針對HER2的七肽分子FITCLTVSPWY由蘇州特瑞藥業(yè)有限公司負(fù)責(zé)合成，熒光顯像使用日本Olympus公司的倒置熒光顯微鏡。細(xì)胞培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)皿為美國Fisher Scientifc公司產(chǎn)品。DMEM培養(yǎng)液及胎牛血清購自美國Hyclone公司，采用美國GE公司的HDx 3.0T MRI儀。其余實驗材料均為美國Sigma公司產(chǎn)品。表達HER2的人乳腺癌細(xì)胞株SKBR3、MCF-7及HER2表達陰性的乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231由西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心劉培軍教授惠贈。

1.2 制備靶向探針FITC-LTVSPWY-Gd-DTPA 取0.2 ml過碘酸鈉（NaIO4）干燥粉末溶于11.1 mg蒸餾水中，充分混勻；取1 ml Gd-DTPA加入NaIO4溶液，室溫下?lián)u勻并放置30 min，隨即加入1 ml乙二醇還原液，搖勻，室溫放置30 min后加入5 mg FITCLTVSPWY，混勻過夜，取1 mg硼氫化鈉干燥粉末溶于100 μl蒸餾水中，混勻后加入上一步制備的溶液中，于4℃冰箱放置2 h，即獲得靶向分子探針FITCLTVSPWY-Gd-DTPA。

1.3 瓊脂糖凝膠電泳分析 灌制1%瓊脂糖凝膠，分別加入3 μl靶向分子探針FITC-LTVSPWY-Gd-DTPA和非靶向探針FITC-LTVSPWY進行瓊脂糖凝膠電泳分離，電壓70 V，電泳時間60 min。

1.4 靶向探針弛豫率檢測 將FITC-LTVSPWY-Gd-DTPA和Gd-DTPA以 濃 度 為6.25、12.5、25、50、100、200 μg/ml分別溶于去離子水中，采用腕關(guān)節(jié)線圈，運用后臺感興趣區(qū)測量工具測出T1值，計算弛豫率。掃描參數(shù)：視野120 mm，矩陣256×128，層厚1.5 mm，TE7.8 ms，TR3000 ms，層間距0，翻轉(zhuǎn)角90°，采集次數(shù)4次，掃描時間15～20 min。

1.5 乳腺癌細(xì)胞爬片的制備與熒光染色 用89% DMEM、10%胎牛血清和1%抗生素培養(yǎng)基培養(yǎng)HER2表達陽性的乳腺癌細(xì)胞MCF-7，待其生長至對數(shù)生長期，用1 ml 0.25%胰酶消化3 min后，再用含胎牛血清的培養(yǎng)基中和，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105/ml。將細(xì)胞接種于載玻片上孵育24 h，待細(xì)胞貼壁后用丙酮固定30 min，以磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌5次、每次5 min后備用。將5 mmol/L FITC-LTVSPWY-Gd-DTPA滴至制備好的乳腺癌細(xì)胞爬片上，37℃孵育30 min，用PBS反復(fù)沖洗后于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞表面的熒光分布。

1.6 細(xì)胞體外MRI 于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)HER2表達陽性的人乳腺癌細(xì)胞SKBR3、MCF-7及HER2表達陰性的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，待細(xì)胞均生長至對數(shù)生長期時，分別加入30、60、120、240 nmol/ml靶向探針FITC-LTVSPWY-Gd-DTPA作為實驗組和非靶向探針Gd-DTPA作為對照組，以不添加任何探針的細(xì)胞作為空白組，每組3個平行管。將各組細(xì)胞37℃孵育一定時間后棄去培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，每次5 min后用胰酶消化3 min，再以800 r/min離心5 min，在所得細(xì)胞團塊內(nèi)加入1%瓊脂糖和800 μl PBS充分混勻，裝入1.5 ml EP管中，進行MRI。采用腕關(guān)節(jié)線圈，選擇快速自旋回波序列進行T1WI掃描，掃描參數(shù)：TR 440 ms，TE 149 ms，視野 60 mm，層厚2 mm，無間距掃描，矩陣256×192，采集次數(shù) 4，翻轉(zhuǎn)角90°。由2名MRI主任醫(yī)師采用雙盲法觀察并確定各組細(xì)胞T1WI信號的差異，意見不一致時協(xié)商達成一致。

2 結(jié)果

2.1 瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，非靶向探針Gd-DTPA條帶遷移速度較快，形成較亮片段；靶向探針FITC-LTVSPWY-Gd-DTPA條帶基本未遷移，見圖1。由此證明兩種探針的分子量及電荷均不同。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳圖。泳道1為非靶向探針Gd-DTPA，遷移速度較快，形成高亮片段；泳道2為靶向探針FITC-LTVSPWY-Gd-DTPA，條帶處于初始孔，基本未遷移

2.2 探針弛豫率檢測與熒光染色結(jié)果 MRI結(jié)果顯示隨著溶液中Gd離子濃度的增高，T1WI序列的弛豫時間變短，信號變亮。運用后臺程序測量各管的T1值計算出Gd-DTPA和FITC-LTVSPWY-Gd-DTPA的弛豫率分別為4.560 L/(mmol-s)和5.330 L/(mmol-s)。制備的MCF-7細(xì)胞爬片顯微鏡下示細(xì)胞分布均勻，形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，生存狀態(tài)良好（圖2）。與靶向探針FITCLTSPWY-Gd-DTPA共同孵育后于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)良好，分布均一，細(xì)胞膜表面清晰，可見均勻分布的綠色熒光，細(xì)胞內(nèi)熒光較弱（圖3），由此證明靶向探針FITC-LTSPWY-Gd-DTPA可以與膜受體HER2特異性地結(jié)合。

圖2 倒置顯微鏡下觀察MCF-7細(xì)胞爬片，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，狀態(tài)良好，分布均勻

圖3 熒光顯微鏡下觀察MCF-7細(xì)胞爬片與靶向探針孵育結(jié)果，綠色熒光均勻分布于細(xì)胞表面，細(xì)胞內(nèi)較弱，證明靶向探針可以與HER2陽性細(xì)胞特異性地結(jié)合

2.3 細(xì)胞MRI結(jié)果 實驗組、對照組與空白組細(xì)胞經(jīng)MRI掃描示靶向探針FITC-LTVSPWY-Gd-DTPA處理的HER2表達陽性的SKBR3與MCF-7細(xì)胞在同一TE下均呈明顯短T1高信號，2種細(xì)胞的信號視覺差異不明顯，而HER2表達陰性的MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)靶向探針處理后在同一TE下呈等T1信號，其與HER2表達陽性細(xì)胞的MR信號有明顯的視覺差異；非靶向探針Gd-DTPA處理的對照組3種細(xì)胞均呈T1稍高信號，細(xì)胞間視覺差異不明顯；空白組及背景瓊脂糖MR掃描均呈T1等信號，不同種類細(xì)胞間的信號強度差異不明顯（圖4、5）。每組設(shè)立的3個平行管之間信號均無明顯視覺差異。

圖4 HER2高表達的SKBR-3細(xì)胞、中等表達的MCF-7細(xì)胞和HER2陰性的MDA-MB-231細(xì)胞的T1WI結(jié)果。同一種細(xì)胞靶向探針呈明顯高信號，非靶向探針呈稍高信號，空白組呈等信號

圖5 不同濃度探針與SKBR3細(xì)胞的體外T2WI圖。在同一探針濃度下，靶向探針呈明顯高信號，非靶向探針呈稍高信號，空白組呈等信號。同一組內(nèi)，隨著探針孵育濃度的增大，信號逐漸增強

3 討論

腫瘤標(biāo)志物靶向治療藥物的選擇與個體化治療一直是研究的熱點問題[8]。與大分子抗體相比，小分子多肽具有分子量小、易穿透腫瘤組織、不產(chǎn)生機體免疫反應(yīng)及便于修飾改造等優(yōu)點，更具有發(fā)展與應(yīng)用前景[9,10]。LTVSPWY是Shadidi等[11]通過噬菌體庫篩選技術(shù)篩選出的一種針對HER2包含7個氨基酸的短肽。Wang等[12]證實通過將LTVSPWY與α-TOS結(jié)合，可以使MDA-MB-453細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡，為制備LTVSPWY與MR順磁性分子耦聯(lián)物用于MR靶向成像提供了理論依據(jù)。

Gd-DTPA是經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)并廣泛應(yīng)用于臨床的成熟的MR陽性對比劑，屬于細(xì)胞外間隙造影劑，在低濃度狀態(tài)時對機體T1弛豫時間影響較大，通過縮短氫質(zhì)子的弛豫時間而影響被引入組織的T1弛豫時間，且GdIII與DTPA螯合后可以減少其在體內(nèi)的毒副作用[13-15]。然而，Gd-DTPA血漿滲透壓較大，進入機體后在動脈相能夠快速進入細(xì)胞外間隙，濃度達到峰值而使組織背景信號增強，當(dāng)細(xì)胞間隙對比劑濃度降低時，T1WI信號強度隨之衰減。在整個MRI增強掃描過程中，釓對比劑僅在動脈、毛細(xì)血管網(wǎng)、細(xì)胞外間隙和靜脈內(nèi)存在，不能進入細(xì)胞內(nèi)，因而無法實現(xiàn)針對病變組織的靶向成像[15-17]?；诖耍n題組計劃選擇能與HER2特異性地結(jié)合的七肽小分子LTVSPWY與順磁性粒子Gd通過DTPA連接后獲得具有成像靶向性的MR分子探針。

在制備靶向探針前，為了進一步證明七肽分子LTVSPWY具有針對HER2的靶向性，本研究采用熒光標(biāo)記LTVSPWY，與HER2高表達乳腺癌細(xì)胞共同孵育后，在熒光顯微鏡下觀察到乳腺癌細(xì)胞表面均勻分布的綠色熒光，從而進一步證實了LTVSPWY對HER2的靶向性。

DTPA是常用的耦聯(lián)劑，研究中先經(jīng)NaIO4將DTPA的氨基氧化為醛基，再使醛基與酪氨酸的氨基反應(yīng)生成shifft堿，生成物化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，且該反應(yīng)在液相一步合成，操作簡單，耦聯(lián)效率高。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示所制備的靶向探針符合預(yù)期分子量。在MRI儀下檢測靶向探針FITC-LTVSPWY-Gd-DTPA的弛豫率高于非靶向探針Gd-DTPA，其原因在于靶向探針分子量大，側(cè)鏈增長后分子體積變大，使分子旋轉(zhuǎn)相關(guān)時間延長，從而使弛豫率增加。理論上弛豫率越大，對比性越好，成像效果越佳。進一步對HER2表達陽性的腫瘤細(xì)胞進行MR體外成像，結(jié)果顯示同一種細(xì)胞在同一TE下，加入靶向探針的2種乳腺癌細(xì)胞的T1弛豫時間較加入非靶向探針的腫瘤細(xì)胞明顯縮短，呈高亮信號。經(jīng)非靶向探針Gd-DTPA處理過的細(xì)胞T1WI呈稍高信號，可能是由于Gd-DTPA沉積在細(xì)胞間隙未能被PBS徹底洗滌所致。

此外，作為探索性研究，本實驗未探討探針濃度、成像時間及腫瘤HER2表達水平與MRI信號之間相關(guān)性，需在后續(xù)實驗中進一步深入研究課題。

總之，本課題組通過耦聯(lián)技術(shù)自行制備的MR靶向探針具有良好的物理和磁學(xué)特性，體外細(xì)胞成像顯示出針對乳腺癌HER2靶向成像效果，為下一步進行體內(nèi)成像研究奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 張春輝）

Preparation of HER2-targeted Molecular Probe and Its MR Imaging in Vitro

PurposeTo prepare human epidermal growth factor receptor 2 (HER2)-targeted MR molecular probes with paramagnetic particle gadolinium as carrier, and to provide imaging data for individualized treatment of breast cancer through its targeted MR imaging.Materials and MethodsThe HER2-targeted molecular probe was made by conjugating fuorescent labeling probe FITC-LTVSPWY and Gd-DTPA prepared by our research group earlier. Positive expressions like human breast cancer cell SKBR3 and MCF-7 and negative expression like MDA-MB-231 were selected as observe objects. Those cells incubated with FITC-LTVSPWY-Gd-DTPA were taken as experimental group, those with Gd-DTPA as control group, and those without any probe as blank control group. Then MRI was performed in vitro and T1WI signal of cells was collected and assessed visually.ResultsThe strong signals on T1WI were observed in the experimental group, the control group and the blank control group both showed iso-intense signals, and visual difference could be detected.ConclusionThe HER2-targeted MR probe prepared by our research group shows good magnetic features. It can target HER2 in the detection of breast cancer cells in vitro, which can be used in further research on imaging in vivo.

Breast neoplasms; Targeted probe; Gadolinium; Human epidermal growth factor receptor; Magnetic resonance imaging

1. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院PET/CT室陜西西安 710061

2. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科陜西西安 710061

段小藝

Department of PET/CT, the First Affliated Hospital of Xi'an Jiaotong University, Xi'an 710061, China

Address Correspondence to: DUAN Xiaoyi

E-mail: duanxiaoy@mail.xjtu.edu.cn

國家自然科學(xué)基金面上項目（81171397）。

R-33；R445.2

2013-12-04

修回日期：2014-03-20

中國醫(yī)學(xué)影像學(xué)雜志

2014年 第22卷 第4期：336-339

Chinese Journal of Medical Imaging

2014 Volume 22(4): 336-339

10.3969/j.issn.1005-5185.2014.05.005