寧科賢，黃燕萍（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，南寧 530021；2.廣西北海食品藥品檢驗(yàn)所，廣西北海 536000）

雙黃連顆粒是由金銀花、黃芩、連翹3味中藥經(jīng)適宜加工、提取制成的中成藥，收載于《中國(guó)藥典》2010年版（一部）[1]，具有疏風(fēng)解表、清熱解毒之功效，臨床用于治療外感風(fēng)熱所致的感冒，癥見發(fā)熱、咳嗽、咽痛。原標(biāo)準(zhǔn)僅有黃芩苷和連翹苷的含量測(cè)定項(xiàng)。有文獻(xiàn)報(bào)道單獨(dú)或同時(shí)測(cè)定雙黃連顆粒中綠原酸、連翹苷、黃芩苷的含量[2-5]，但尚未見同時(shí)測(cè)定該制劑中綠原酸、木犀草苷、連翹苷和黃芩苷4 種成分含量的報(bào)道。本試驗(yàn)參考有關(guān)文獻(xiàn)[1-12]，建立了以高效液相色譜（HPLC）法同時(shí)測(cè)定雙黃連顆粒中綠原酸、木犀草苷、連翹苷和黃芩苷含量的方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

1200 型HPLC 儀，包含Agilent 1200 LC 色譜工作站、G1322A（DEGASSER）溶劑脫氣機(jī)、G1311A（Quat Pump）四元泵、G1329A（ALS）自動(dòng)進(jìn)樣器、G1314B VWD 紫外檢測(cè)器（美國(guó)Agilent 公司）；CP225D 型電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；AW-120 型電子天平（西班牙COBOS 公司）；SB3200S 型超聲波清洗器[必能信超聲（上海）有限公司]；HT-203A column HEATER型柱溫箱（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）。

綠原酸、木犀草苷、連翹苷和黃芩苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110753-201314、111720-201106、110821-201112、110715-200815，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：96.6%、99.3%、91.8%、95.2%）；雙黃連顆粒（哈爾濱兒童制藥廠有限公司，批號(hào)： 130332；哈藥集團(tuán)中藥二廠，批號(hào)：130629、130526）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.4%磷酸溶液（B），采用梯度洗脫（梯度洗脫程序見表1）；檢測(cè)波長(zhǎng)：277 nm；流速：0.80 ml/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10μl。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Tab 1 Mobile phase gradient elution program

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取綠原酸、木犀草苷、連翹苷和黃芩苷對(duì)照品適量，以甲醇為溶劑，配制成每1 ml含綠原酸0.391 mg、木犀草苷0.084 mg、連翹苷0.183 mg、黃芩苷0.415 mg的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物適量，研細(xì)，取約0.2 g，精密稱定，精密加入70%甲醇20 ml，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率：250 W，頻率：40 kHz）30 min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，中速濾紙濾過，濾液再用0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方中藥味的比例，分別制備不含黃芩、不含連翹和不含金銀花的模擬樣品，按其工藝制成陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各適量，注入HPLC儀，進(jìn)樣，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可見，綠原酸峰、木犀草苷峰、連翹苷峰和黃芩苷峰與相鄰組分峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)按綠原酸峰計(jì)大于9 000；且陰性樣品在對(duì)照品色譜峰相應(yīng)的位置上無吸收峰出現(xiàn)，表明處方中的其他成分對(duì)測(cè)定結(jié)果無影響。

圖1 高效液相色譜圖A.混合對(duì)照品；B.供試品；C 缺黃芩陰性對(duì)照；D：缺連翹陰性對(duì)照；E.缺金銀花陰性對(duì)照；1.綠原酸；2.木犀草苷；3.連翹苷；4.黃芩苷Fig 1 HPLC chromatogramsA.substance control；B.test sample；C.negative control without Scutellaria baicalensis；D.negative control without Forsythia suspensa；E.negative control without Lonicera japonica；1.chlorogenic acid；2.luteolin；3.forsythin；4.baicalin

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 ml，分別置于10 ml 量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜。以檢測(cè)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，μg/ml），峰面積（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程及線性范圍詳見表2。

表2 回歸方程及線性范圍Tab 2 Regression equations and linear ranges

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液10μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定峰面積。結(jié)果，綠原酸、木犀草苷、連翹苷和黃芩苷峰面積的RSD 分別為0.61%、0.95%、0.73%和0.32%，表明儀器的精度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：130332）適量，分別在放置0、1、2、4、6、8、10、12 h 時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10μl，測(cè)定峰面積。結(jié)果，綠原酸、木犀草苷、連翹苷和黃芩苷峰面積的RSD 分別為0.91%、1.07%、0.88%和0.91%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：130332）細(xì)粉約0.2g，共6 份，精密稱定，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，各按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10μl，測(cè)定并計(jì)算含量。結(jié)果，綠原酸、木犀草苷、連翹苷和黃芩苷的平均含量分別為1.476 5、0.235 3、2.413 6、24.384 2 mg/g，RSD 分別為1.02%、1.23%、0.87%、0.79%，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知各成分含量的樣品（批號(hào)：130332）細(xì)粉9份，每份約0.1 g，精密稱定，每3份分別精密加入一定量的綠原酸、木犀草苷、連翹苷和黃芩苷對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。

2.9 樣品含量測(cè)定

取不同批號(hào)的雙黃連顆粒，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定峰面積，以外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算綠原酸、木犀草苷、連翹苷和黃芩苷的含量，結(jié)果見表4。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 3 Result of recovery tests（n＝9）

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n＝3）Tab 4 Results of content determination of samples（mg/g，n＝3）

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

本試驗(yàn)參照《中國(guó)藥典》2010年版（一部）比較了甲醇-水-冰醋酸（50 ∶5 ∶1，V/V/V）、乙腈-水（25 ∶75，V/V）、甲醇-水-磷酸（47 ∶53 ∶0.2，V/V/V）、乙腈-0.4%磷酸溶液（13 ∶87，V/V）、甲醇-0.4%磷酸溶液等不同流動(dòng)相的出峰情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)雙黃連顆粒而言選擇甲醇-0.4%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，待測(cè)成分分離較好且峰形較佳。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

經(jīng)紫外-可見分光光度法測(cè)定，綠原酸在277 和324 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，連翹苷的最大吸收波長(zhǎng)為277 nm，黃芩苷在276 和315 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，木犀草苷在255 和350 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。進(jìn)而比較了混合對(duì)照品溶液各成分在255和277 nm波長(zhǎng)下的峰面積，發(fā)現(xiàn)綠原酸變化不大，木犀草苷在277 nm 下的峰面積是255 nm 下的61%，而連翹苷在255 nm下的信號(hào)很弱，黃芩苷的信號(hào)則增強(qiáng)了2.5倍。故最終選用277 nm為本試驗(yàn)的測(cè)定波長(zhǎng)，以提高各種成分的檢測(cè)靈敏度。

3.3 提取溶劑及方法的選擇

分別用甲醇、70%甲醇和70%乙醇加熱回流或超聲處理等進(jìn)行樣品提取考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用70%甲醇超聲處理（功率：250 W，頻率：40 kHz）30 min 提取效果最佳。故本試驗(yàn)最終選用此提取溶劑及方法。

3.4 其他

表4 的結(jié)果表明，不同生產(chǎn)廠家的綠原酸、連翹苷含量差異較大；而同一廠家不同批號(hào)的產(chǎn)品則是木犀草苷和黃芩苷含量差異較大，這可能是由于藥材的品質(zhì)及工藝的差別所造成。但是，各廠家藥物的用法與用量卻相同，這使得本品在臨床應(yīng)用時(shí)，有可能會(huì)產(chǎn)生較大的藥效偏差，甚至產(chǎn)生副作用。因此，為了保證患者的用藥安全，需更好地完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以有效反映制劑質(zhì)量。

綜上所述，本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于雙黃連顆粒的質(zhì)量控制。

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