柴鑫莉，陳 蕾，舒金富（衢州市食品藥品檢驗(yàn)所，浙江衢州 324000）

感冒止咳顆粒是由柴胡、山銀花、葛根、青蒿、連翹、黃芩、桔梗、苦杏仁提取物與薄荷腦制成的顆粒制劑[1]，具有解表清熱、止咳化痰之功效，常用于外感風(fēng)熱所致的感冒發(fā)熱、頭痛鼻塞、傷風(fēng)咳嗽、喉嚨腫痛等。山銀花、葛根和黃芩均為感冒止咳顆粒的主藥，其有效成分分別為綠原酸、葛根素和黃芩苷。目前，關(guān)于感冒止咳顆粒成分的定性和定量分析的報(bào)道較多，但僅為單一的測(cè)定某一種成分，如測(cè)定綠原酸[2-4]、葛根素[5-7]、黃芩苷[8-9]、連翹苷[10-11]。為了更全面的保障感冒止咳顆粒的質(zhì)量，在本研究中筆者采取多波長(zhǎng)切換高效液相色譜（HPLC）法同時(shí)測(cè)定了感冒止咳顆粒中綠原酸、葛根素和黃芩苷的含量。

1 材料

1.1 儀器

Ultimate 3000 型HPLC 儀，包括真空在線脫氣泵、LPG-3400SD 四元泵、WPS-3000 自動(dòng)進(jìn)樣器、Tcc-3x00 柱溫箱、VWD-3x00 紫外檢測(cè)器、Chromeleon 7 工作站（美國(guó)thermo 公司）；Mettler FE20 Ph 計(jì)（瑞士梅特勒-托利多公司）；Mettler XP205十萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 藥品與試劑

綠原酸對(duì)照品、葛根素對(duì)照品、黃芩苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110753-201314、110752-200209、110715-201117）；感冒止咳顆粒（A廠，批號(hào)：ZJ12008、ZJ12009、ZHB1303、ZJB1311；B廠，批號(hào)：131005；C廠，批號(hào)：1 312204；D廠，批號(hào)：20130901）；甲醇（色譜純，美國(guó)Media 試劑公司）；其他試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為ph2.6磷酸溶液，采用梯度洗脫（梯度洗脫見表1）；柱溫：25 ℃；流速：0.8 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：327 nm（0～9 min），250 nm（9.1～15 min），280 nm（15.1～30 min）；進(jìn)樣量：10 μl。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution process

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取綠原酸、葛根素、黃芩苷對(duì)照品適量，置于不同的50 ml 量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到質(zhì)量濃度分別為0.468、0.196、0.390 mg/ml 的對(duì)照品貯備液。分別精密量取上述對(duì)照品貯備液各1.0、5.0、5.0 ml，置于同一25 ml 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 稱取感冒止咳顆粒適量，研細(xì)，精密稱定粉末1 g，置于50 ml 棕色量瓶中，加入30%甲醇適量，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min（功率：250 W，頻率：40 kHz），放冷，加入30%甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm孔徑微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性溶液的制備 按處方中各藥材的比例制備不含山銀花、葛根和黃芩的陰性對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密吸取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液、混合對(duì)照品溶液、陰性溶液各10 μl，注入HPLC儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見圖1。在該色譜條件下，綠原酸、葛根素和黃芩苷均能達(dá)到基線分離，保留時(shí)間分別是7.44、11.24、21.97 min，理論板數(shù)按綠原酸計(jì)算不低于4 000。

圖1 高效液相色譜圖A.陰性溶液；B.混合對(duì)照品溶液；C.供試品溶液；1.綠原酸；2.葛根素；3.黃芩苷Fig 1 HPLC chromatogramsA .negative solution；B.mixed control；C.test sample；1.chlorogenic acid；2.puerarin；3.baicalin

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下綠原酸對(duì)照品貯備液、葛根素對(duì)照品貯備液、黃芩苷對(duì)照品貯備液各適量，加水制成不同系列濃度的混合對(duì)照品溶液。分別吸取上述溶液10 μl，注入HPLC儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以檢測(cè)質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程及線性范圍見表2。

表2 回歸方程及線性范圍Tab 2 Regression equation and linear range

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次。結(jié)果，綠原酸、葛根素、黃芩苷峰面積的RSD 分別為0.08%、0.06%、0.08%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：ZJ12008）適量，分別室溫密閉放置0、2、4、6、8、10、12 h時(shí)，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，綠原酸、葛根素、黃芩苷峰面積的RSD分別為2.37%、0.10%、2.98%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：ZJ12008）適量，共6 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，綠原酸、葛根素、黃芩苷峰面積的RSD 分別為1.11%、0.32%、3.41%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

稱取已知含量的樣品（批號(hào)：ZJ12008），共9 份，分別取“2.2.1”項(xiàng)下綠原酸對(duì)照品貯備液0.8、1.0、1.2 ml，葛根素對(duì)照品貯備液3.0、4.0、5.0 ml，黃芩苷對(duì)照品貯備液2.5、3.0、3.5 ml，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 3 Results of recovery tests（n＝9）

2.9 樣品含量測(cè)定

取7批感冒止咳顆粒樣品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算3種成分的含量，結(jié)果見表4。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n＝3）Tab 4 Content determination of sample（mg/g，n＝3）

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

感冒止咳顆粒中綠原酸、黃芩苷在堿性條件下不穩(wěn)定。有研究報(bào)道了綠原酸、葛根素和黃芩苷的檢定方法[2-9]，分別比較了以乙腈-0.2%磷酸溶液、甲醇-1.8%磷酸溶液、甲醇-0.2%磷酸溶液、甲醇-ph2.6 磷酸溶液、甲醇-1%醋酸溶液等為洗脫溶劑，同時(shí)比較了流速分別為0.8、1.0 ml/min，柱溫分別為25、30 ℃時(shí)各成分的分離度。發(fā)現(xiàn)當(dāng)流速為0.8 ml/min，柱溫為25 ℃，流動(dòng)相為甲醇-ph2.6 磷酸溶液，采用梯度洗脫時(shí)，各成分分離度均較好。

3.2 提取溶劑的選擇

筆者通過比較乙醇、30%乙醇、70%乙醇、甲醇、30%甲醇、70%甲醇等不同溶劑對(duì)樣品提取的效果，發(fā)現(xiàn)甲醇、30%甲醇、70%甲醇的提取效果均較好，但甲醇、70%甲醇均影響各成分的分離度及峰型，故選擇30%甲醇為提取溶劑。

3.3 提取方法的選擇

在本研究中筆者分別觀察了超聲提取、回流提取樣品，結(jié)果表明兩種提取方法測(cè)得的各成分含量均無明顯差異，但超聲提取更簡(jiǎn)便、快捷，故選擇超聲提取。同時(shí)又比較了超聲提取15、30、45、60 min時(shí)各成分的含量，發(fā)現(xiàn)當(dāng)超聲提取30 min時(shí)各成分含量無明顯變化，故選擇超聲提取30 min。

3.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

筆者分別對(duì)綠原酸、葛根素、黃芩苷進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)綠原酸、葛根素、黃芩苷的最大吸收波長(zhǎng)分別在327、250、280 nm處。如在同一波長(zhǎng)下檢測(cè)將損失某些成分的檢測(cè)靈敏度，故選擇多波長(zhǎng)切換HPLC 法，分別在各成分最大紫外吸收波長(zhǎng)處進(jìn)行檢測(cè)，使各成分在相應(yīng)波長(zhǎng)下有最大吸收。

3.5 樣品含量測(cè)定結(jié)果

本研究對(duì)4 個(gè)廠家7 批感冒止咳顆粒進(jìn)行測(cè)定，綠原酸、葛根素、黃芩苷的含量在0.289～1.045、0.578～2.064、2.073～3.027 mg/g 范圍內(nèi)，相同廠家不同批次間的含量值較接近，不同廠家之間含量差距較大，可能與不同廠家的原料來源和制備工藝不同的有關(guān)。

綜上所述，本方法簡(jiǎn)便、快速、重復(fù)性好，可用于感冒止咳顆粒的質(zhì)量控制。

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