徐元玲綜述，王建東，蔣琪霞審校

0 引 言

慢性傷口因持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、影響因素多而易發(fā)感染甚至形成難以處理的細(xì)菌生物膜，增加了治療難度，影響愈合效果［1］。臨床多見于壓瘡、糖尿病足潰瘍、下肢動(dòng)靜脈潰瘍等慢性傷口［2］。如何識(shí)別細(xì)菌生物膜及其病原菌是臨床有效干預(yù)的前提，文中就慢性傷口細(xì)菌生物膜的臨床識(shí)別和生物膜形成的影響因素進(jìn)行綜述。

1 慢性傷口細(xì)菌生物膜臨床識(shí)別

1.1 細(xì)菌生物膜感染的檢測(cè)識(shí)別技術(shù) 慢性傷口細(xì)菌生物膜就是細(xì)菌附于傷口床，與自身分泌的細(xì)胞外基質(zhì)成分相互融合形成的一種膜狀組織［1］。由于其結(jié)構(gòu)微小，肉眼難以識(shí)別，臨床上通常使用細(xì)菌培養(yǎng)來(lái)檢測(cè)傷口中存在的細(xì)菌。細(xì)菌培養(yǎng)對(duì)診斷急性傷口感染相當(dāng)準(zhǔn)確，但對(duì)于細(xì)菌生物膜引發(fā)的慢性感染的診斷卻并不可靠［3］。傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)取樣用無(wú)菌拭子擦拭傷口床獲取分泌物樣本，由于細(xì)菌定植部位的隱蔽性，大量厭氧菌隱藏于傷口深部組織，無(wú)菌拭子并不能充分全面地觸及傷口基底，因此培養(yǎng)結(jié)果通常無(wú)法發(fā)現(xiàn)厭氧菌存在［4］。有研究發(fā)現(xiàn)，在生物膜感染病例中，陰性培養(yǎng)結(jié)果常與明顯的感染癥狀和體征不符，造成這一現(xiàn)象的原因可能與樣本取材不充分、培養(yǎng)時(shí)間不長(zhǎng)或培養(yǎng)基中養(yǎng)分缺乏有關(guān)［5］。此外，細(xì)菌培養(yǎng)是采用實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法使細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖，培養(yǎng)過(guò)程中易受污染，且耗時(shí)長(zhǎng)、特異性差、敏感度低，易導(dǎo)致假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果，所以傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)常會(huì)低估慢性傷口中細(xì)菌數(shù)量和種類。為提高慢性感染性疾病生物膜內(nèi)細(xì)菌的檢出率，現(xiàn)已發(fā)展出一些新的檢測(cè)手段，如聚合酶鏈反應(yīng)、熒光原位雜交技術(shù)、變性梯度凝膠電泳及16S核糖體核糖核酸序列分析等分子生物技術(shù)［6］。這些技術(shù)主要是對(duì)細(xì)菌染色體或染色體外的DNA片段進(jìn)行分析，從遺傳進(jìn)化的角度和分子水平進(jìn)行細(xì)菌分類鑒定，從而使細(xì)菌分類更科學(xué)、更精確，特別是分子技術(shù)花費(fèi)時(shí)間短，通常24h即能反饋細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果，為臨床有針對(duì)性的傷口干預(yù)措施提供有效證據(jù)。另有研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)方法和革蘭氏染色法在分泌性中耳炎患者耳腔中檢測(cè)到的細(xì)菌陽(yáng)性率低于30%，而使用分子生物技術(shù)檢測(cè)陽(yáng)性率則高達(dá)90%以上［7］。因此，分子生物技術(shù)的發(fā)展大大提高識(shí)別菌膜感染的準(zhǔn)確性和科學(xué)性。

1.2 細(xì)菌生物膜感染的實(shí)驗(yàn)和臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 細(xì)菌生物膜感染的實(shí)驗(yàn)診斷標(biāo)準(zhǔn) Parsek等［8］提出了通過(guò)檢測(cè)臨床相關(guān)標(biāo)本診斷生物膜感染的Parsek-Singh實(shí)驗(yàn)診斷標(biāo)準(zhǔn)，具體包括:①與傷口表面相關(guān)的細(xì)菌感染;②獲取的傷口組織病理檢查見細(xì)菌聚集并包被于基質(zhì)中;③感染局限于宿主的某一特定部位，伴或不伴全身感染;④細(xì)菌對(duì)敏感抗生素產(chǎn)生耐藥性。基于生物膜感染的抗生素耐藥特性和抗宿主免疫反應(yīng)的特性，Stoodley等［9］在2008年建議對(duì)上述生物膜感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)作如下2點(diǎn)補(bǔ)充:①應(yīng)用細(xì)菌直接活力染色法結(jié)合分子診斷學(xué)技術(shù)如逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或熒光原位雜交技術(shù)證實(shí)有活性細(xì)菌聚集物的存在;②宿主組織中散在分布有細(xì)菌聚集群(大菌落)并伴炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，證明宿主無(wú)有效清除細(xì)菌的能力。

1.2.2 細(xì)菌生物膜感染的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn) 既往研究報(bào)道，細(xì)菌生物膜感染病例的臨床特征包括:蒼白的傷口床，黃色滲液，壞死組織，清亮組織液，有腐臭味，脆弱的肉芽組織及細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果［10］。通常當(dāng)傷口出現(xiàn)上述特征之一時(shí)，建議在嚴(yán)格無(wú)菌操作下取組織活檢或行細(xì)菌培養(yǎng)，再使用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察到包裹在細(xì)菌表面的胞外多糖物質(zhì)，這是診斷生物膜存在的重要陽(yáng)性特征［11］。目前對(duì)可疑病例采用分子技術(shù)準(zhǔn)確快速識(shí)別傷口中的細(xì)菌生物膜已成為研究熱點(diǎn)。未來(lái)需要根據(jù)臨床表現(xiàn)結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，制定更為明確可行的細(xì)菌生物膜診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 慢性傷口細(xì)菌生物膜中的細(xì)菌識(shí)別結(jié)果 慢性傷口細(xì)菌生物膜中細(xì)菌種類繁多，通常有3～10種占主導(dǎo)地位的微生物，另有數(shù)以百計(jì)的其他不同類微生物，且不同類型的慢性傷口，其細(xì)菌生物膜內(nèi)所含細(xì)菌亦不相同［12］。

過(guò)往研究對(duì)不同類型的慢性傷口提取標(biāo)本，使用細(xì)菌標(biāo)記的焦磷酸擴(kuò)增測(cè)序法(Bacterial tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing，bTEFAP)檢測(cè)和總結(jié)出傷口生物膜中的細(xì)菌種類和分布規(guī)律［12］。Dowd等［12］在2008年收集了40例不同糖尿病足潰瘍患者傷口清創(chuàng)物質(zhì)的標(biāo)本，通過(guò)提取DNA，使用bTEFAP技術(shù)檢測(cè)觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)棒桿菌屬最常見的厭氧菌，其它細(xì)菌包括沙雷氏菌、鏈球菌、金葡菌及腸球菌等。Wolcott等［13］在2009年觀察了40例慢性下肢靜脈性潰瘍生物膜中的細(xì)菌分布，主要為金黃葡萄球菌、鏈球菌、假單胞菌、沙雷菌、棒狀桿菌屬、大腸埃希菌、凝固酶陰性的葡萄球菌、真菌和厭氧菌等，還有許多尚不知名的細(xì)菌，其中 兼性厭氧菌占51%，專性厭氧菌占30%。Smith等［14］在2010年對(duì)49例壓瘡組織樣本進(jìn)行檢測(cè)，主要為鏈球菌、棒桿菌屬、金黃色葡萄球菌、厭氧菌及假單胞菌等共212個(gè)菌屬，487個(gè)細(xì)菌種類，其中厭氧菌占31%，兼性厭氧菌占43%。

傷口感染是多種細(xì)菌共同作用的結(jié)果，特別是厭氧菌的存在，盡管數(shù)量微小，卻可能破壞傷口正常生理愈合機(jī)制［15－16］。因此，在臨床傷口處理中需要特別關(guān)注類如外口小內(nèi)腔大的壓瘡傷口、竇道等無(wú)氧環(huán)境下有無(wú)厭氧菌或兼性厭氧菌的生存，如有可疑，建議取深部組織送分子病理檢測(cè)，同時(shí)局部使用3%過(guò)氧化氫溶液沖洗，與局部充分作用后再用等滲鹽水二次沖洗，填充或覆蓋廣譜抗菌的銀敷料抑制其生長(zhǎng)繁殖［17］，且每周至少跟蹤評(píng)價(jià)2次臨床效果，每2－3周跟蹤評(píng)價(jià)細(xì)菌檢測(cè)結(jié)果。

2 慢性細(xì)菌生物膜形成的影響因素

在傷口由急性轉(zhuǎn)為慢性的過(guò)程中，細(xì)菌受到各種因素影響，如極度營(yíng)養(yǎng)缺乏或過(guò)剩、低pH值、高滲透壓、氧化、抗菌劑和抗生素使用等，這些因素與生物膜的形成與否密切相關(guān)。

2.1 pH值 體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)變異鏈球菌在pH=7.0時(shí)12～24h內(nèi)即可形成穩(wěn)定的生物膜，該生物膜還能抵抗pH=5.0的酸性環(huán)境［18］。還有細(xì)菌形成的生物膜能抵抗堿性環(huán)境，如糞腸球菌能在pH值為7～9的堿性環(huán)境中形成穩(wěn)定的生物膜［19］。但在過(guò)酸(pH＜5.0)和過(guò)堿(pH＞9.0)的環(huán)境中生物膜均不能生長(zhǎng)［20］。生物膜有此特性可能與其結(jié)構(gòu)有關(guān)，細(xì)菌生物膜是由細(xì)胞外基質(zhì)包裹的細(xì)菌群體相互粘附形成三維立體結(jié)構(gòu)，在這種狀態(tài)下，酸堿成分只對(duì)膜內(nèi)表層細(xì)菌有影響，而無(wú)法對(duì)深層細(xì)菌發(fā)揮作用［21－22］。其次，生物膜中營(yíng)養(yǎng)成分的濃度由外向內(nèi)呈現(xiàn)梯度下降，致使深層細(xì)菌長(zhǎng)期處于營(yíng)養(yǎng)缺失狀態(tài)而生長(zhǎng)緩慢，對(duì)酸堿的敏感性也降低，表層菌脫落后代謝產(chǎn)物的積聚也容易有效抵御酸堿的快速滲透。

傷口修復(fù)過(guò)程中肉芽組織生長(zhǎng)需弱酸性環(huán)境，堿性環(huán)境不僅不利于肉芽組織生長(zhǎng)，且有可能激活基質(zhì)金屬蛋白酶，造成傷口組織自噬。我們懷疑生物膜與肉芽生長(zhǎng)的弱酸性環(huán)境相競(jìng)爭(zhēng)，從而抑制肉芽組織的生長(zhǎng)。有文獻(xiàn)報(bào)道，建議酸化菌膜定植的慢性傷口，營(yíng)造適宜于肉芽組織生長(zhǎng)又能控制菌膜的傷口pH微環(huán)境，促進(jìn)傷口組織修復(fù)［23］。但需要更多臨床試驗(yàn)證實(shí)傷口pH值與生物膜形成的相關(guān)性。

2.2 溫度 溫度也是影響細(xì)菌生物膜形成的一個(gè)重要因素。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著溫度的不斷升高，細(xì)菌生物膜形成速度加快，但超過(guò)40℃時(shí)穩(wěn)定性逐漸降低，30℃ ～35℃是細(xì)菌形成生物膜的合適溫度［20］。而此溫度又是傷口組織生長(zhǎng)需要的適宜溫度，推測(cè)在溫度方面生物膜也與肉芽組織存在競(jìng)爭(zhēng)性抑制。臨床上使用物理干預(yù)輔助治療傷口，如遠(yuǎn)紅外線通過(guò)熱輻射效應(yīng)，能提升傷口溫度2℃ ～3℃(33℃ ～35℃)，可促進(jìn)傷口局部血液循環(huán)達(dá)到消炎消腫，減輕疼痛的作用，還可促進(jìn)膠原形成和成纖維細(xì)胞增殖而促進(jìn)傷口愈合［24］。此結(jié)果引發(fā)思考:熱輻射提升傷口溫度后對(duì)生物膜形成有何影響?是否肉芽組織良好生長(zhǎng)能夠抑制生物膜的生長(zhǎng)?如果存在這種競(jìng)爭(zhēng)性抑制，通過(guò)什么途徑調(diào)控?上述問(wèn)題還有待進(jìn)一步研究。

2.3 抗生素和疾病 抗生素治療細(xì)菌生物膜歷來(lái)存在爭(zhēng)議，有文獻(xiàn)報(bào)道，抗生素雖然可殺滅鏈球菌，但卻促進(jìn)銅綠假單胞菌和沙雷菌等其他細(xì)菌形成生物膜，這些細(xì)菌定植于傷口的深層，抗生素難以發(fā)揮作用，導(dǎo)致細(xì)菌持續(xù)存在從而延緩傷口的愈合［25］。疾病也能影響細(xì)菌生物膜生存與否，如糖尿病患者傷口中的鏈球菌是非糖尿病的63倍［25］。

2.4 細(xì)菌基因蛋白改變對(duì)生物膜形成的影響 細(xì)菌間可利用結(jié)合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行基因交換，使浮游細(xì)菌有能力形成生物膜［26］。生物膜成熟過(guò)程中約35%基因表達(dá)發(fā)生改變，如銅綠假單胞菌生物膜的形成過(guò)程中蛋白發(fā)生變異的多達(dá)800余種，增加了臨床處理難度［27］。細(xì)菌定植部位也影響基因活性，銅綠假單胞菌定植部位距離傷口表面通常大于金黃色葡萄球菌，但通過(guò)分泌?；呓z氨酸和鼠李糖脂，可使機(jī)體激活巨噬細(xì)胞的能力減弱，中性粒細(xì)胞凋亡速度加快，且激活基質(zhì)金屬蛋白酶，產(chǎn)生對(duì)傷口組織的自噬作用從而影響傷口愈合［28］。生物膜中的細(xì)菌還可互相利用其優(yōu)點(diǎn)達(dá)到共生目的，金黃葡萄球菌利用白色念珠菌的菌絲穿透上皮層而達(dá)到黏附、入侵破壞組織的目的，兩者互相影響基因和蛋白的表達(dá)，共同促進(jìn)形成生物膜，抵抗機(jī)體免疫和抗生素治療［29－30］。協(xié)同生長(zhǎng)增加了生物膜的致病性，早期定植細(xì)菌的代謝產(chǎn)物可成為晚期定植細(xì)菌生存的基床，所以細(xì)菌生物膜結(jié)構(gòu)堅(jiān)實(shí)穩(wěn)定，不易被破壞［31］。

3 結(jié) 語(yǔ)

目前關(guān)于傷口細(xì)菌生物膜的研究以體外研究為主，得到的大多為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，未來(lái)需要進(jìn)一步在臨床實(shí)驗(yàn)得到驗(yàn)證，且患者個(gè)體差異性是否影響生物膜形成尚需進(jìn)一步研究。此外，臨床在標(biāo)本收集，預(yù)處理及技術(shù)檢測(cè)分析等方面還有待于統(tǒng)一操作流程和加以規(guī)范，避免污染以提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

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