張瑩瑩 梁雪梅 曾文剛 張俊彬

(上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306)

金錢魚(Scatophagus argus)又名金鼓魚,棲息于沿海水域近岸沿礁、海藻叢生地帶,常進(jìn)入咸淡水或淡水河流中,在我國南海及東海南部均有分布。金錢魚具有較強(qiáng)的抗逆性,可直接在不同的鹽度水體中正常生長,是一種典型的廣鹽性魚類(蔡澤平等,2010;宋郁等,2012)。

從海水轉(zhuǎn)入淡水或咸淡水過程中,魚類個(gè)體經(jīng)歷劇烈的鹽度變化,為了維持魚體滲透壓穩(wěn)定,必須進(jìn)行一定的滲透壓調(diào)節(jié)。魚類的滲透調(diào)節(jié)能力,反映了他們對(duì)水環(huán)境的鹽度的適應(yīng),決定了魚類的分布區(qū)域和活動(dòng)范圍(劉珊等,2011)。滲透壓調(diào)節(jié)對(duì)魚類生存十分重要,但迄今為止,仍缺乏對(duì)其機(jī)理的深入研究。目前,關(guān)于滲透壓調(diào)節(jié)的研究主要集中在觀察鰓絲及氯細(xì)胞變化,Na/K-ATPase活性和激素變化等方面,實(shí)際上,這個(gè)過程是由生物體內(nèi)復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)控制(Fiolet al,2007)。哺乳動(dòng)物滲透調(diào)節(jié)信號(hào)通路的研究大多是以細(xì)胞系為模型,然而,在魚類研究中,很少有此方面的報(bào)道(Chowet al,2011)。魚類細(xì)胞系是魚類生物學(xué)研究的重要工具,同時(shí)也是魚類基因功能研究的重要材料(任國誠等,2007)。作為體外研究模型,魚類細(xì)胞系具有諸多的優(yōu)點(diǎn):(1) 成本低,維護(hù)細(xì)胞系并不需要大規(guī)模的養(yǎng)殖設(shè)備;(2) 實(shí)驗(yàn)條件可重復(fù)性,保證實(shí)驗(yàn)的精確性;(3) 結(jié)果精確,避免了外在因素的干擾(張博等,2010)。

自世界上第一個(gè)魚類細(xì)胞系建立以來,魚類細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展十分迅速,而我國魚類細(xì)胞培養(yǎng)起步較晚,培養(yǎng)技術(shù)尚不成熟,尤其是海水魚細(xì)胞培養(yǎng)依然存在很多難點(diǎn)(Qinet al,2006)。建立海水廣鹽性魚類細(xì)胞系可為魚類滲透壓調(diào)節(jié)信號(hào)通路研究提供重要的研究模型。2009年,Lee等將虹鱒魚鰓細(xì)胞系RTG-W1接種在跨膜室上,細(xì)胞直接接觸淡水或海水,模擬體內(nèi)環(huán)境進(jìn)行滲透壓調(diào)節(jié)研究。Chow等(2011)以日本鰻鰓的原代細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料,研究了鰓細(xì)胞在不同的滲透壓調(diào)節(jié)下滲透脅迫轉(zhuǎn)錄因子(Ostf)的作用機(jī)制,為滲透壓調(diào)節(jié)機(jī)制的研究開拓了新的思路。然而在國內(nèi),尚未有關(guān)于此方面的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)首次建立了金錢魚的腎細(xì)胞系,并研究腎細(xì)胞的生長特性,為金錢魚的研究奠定理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)魚 體重 40g左右的金錢魚來自廣東省陽江市養(yǎng)殖基地。實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)一個(gè)月以上,每天喂食兩次。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清(FBS),0.25%胰酶,L-15培養(yǎng)基,堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)(均購于 GBICO 公司),青霉素和鏈霉素(上海微科生物有限公司),DMSO(二甲基亞砜)購于Sigma,CCK-8細(xì)胞增殖試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 金錢魚血清滲透壓 取6條個(gè)體均勻的金錢魚體重(40.71±2.99)g,體長(9.3±0.2)cm,體高(5.5±0.5)cm 用于實(shí)驗(yàn),尾靜脈取血,4°C 靜置過夜,3000rpm離心10min。上層黃色透明液體即為金錢魚血清,使用VAPRO-5520滲透壓儀測(cè)得金錢魚血清滲透壓,每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.2.2 配制細(xì)胞培養(yǎng)液 根據(jù)測(cè)得的血清滲透壓使用滲透壓儀配制等滲培養(yǎng)基,其成分如下:干粉L-15培養(yǎng)基定容至1L,pH調(diào)節(jié)至7.4。原代培養(yǎng)基添加20%胎牛血清(FBS),400U/mL青霉素和400 μg/mL鏈霉素,此外,為了比較堿性生長因子 bFGF對(duì)細(xì)胞的作用,配制兩種原代培養(yǎng)基(A:含有10ng/mL bFGF和 B:不含 bFGF)。傳代培養(yǎng)基添加 10%FBS和100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素。

1.2.3 原代培養(yǎng) 取40g左右金錢魚,用75%酒精擦拭魚體,移至超凈工作臺(tái)內(nèi)無菌取腎,放于無菌培養(yǎng)皿內(nèi),用含有400U/mL青霉素和400μg/mL鏈霉素的PBS液沖洗數(shù)次,洗掉血絲和表面細(xì)菌,用剪刀將腎組織剪成1mm3大小。轉(zhuǎn)移至15mL離心管內(nèi),加入 10倍體積的 0.25%胰酶,28°C水浴鍋消化20—30min,期間不斷震蕩加速細(xì)胞分離。消化完成后,加入含有 20% FBS的培養(yǎng)基終止胰酶消化,用200目濾網(wǎng)過濾,將得到的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15mL離心管中,1000 r/min離心10min,棄上清液,分別用A和B培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞沉淀,然后接種于培養(yǎng)瓶,28°C靜置培養(yǎng),每日觀察細(xì)胞增殖情況,接種后第2天更換1—2mL新鮮培養(yǎng)基,以去除血細(xì)胞和未貼壁細(xì)胞。

1.2.4 傳代培養(yǎng) 原代細(xì)胞長滿單層后開始傳代培養(yǎng):用移液管吸出培養(yǎng)基,每瓶加入 0.5mL胰酶-EDTA消化細(xì)胞,在28°C培養(yǎng)箱內(nèi)放置1min,顯微鏡下觀察細(xì)胞開始變圓時(shí)立即加入培養(yǎng)基終止胰酶消化,初次傳代按 1︰1比例傳代,此后按 1︰2或1︰3比例傳代。

1.2.5 凍存與復(fù)蘇 取對(duì)數(shù)期生長的腎細(xì)胞,胰酶消化,1000r/min離心10min,棄掉上清,向沉淀中加入細(xì)胞凍存液(含20% FBS和10% DMSO的L-15培養(yǎng)液),用吸管輕輕吹打使之充分懸浮,將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到細(xì)胞凍存管中,使用梯度降溫凍存盒,在–80°C冰箱過夜后轉(zhuǎn)至液氮中長久保存。細(xì)胞復(fù)蘇時(shí),取出液氮中凍存1年的金錢魚腎細(xì)胞(SK),迅速置于40°C水浴中加速凍存液融化。待凍存液即將完全融化時(shí),將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15mL離心管中,添加10倍體積的L-15培養(yǎng)基稀釋,1000 r/min離心10min,用含有20% FBS的L-15培養(yǎng)基充分懸浮細(xì)胞,按上述培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng),取少許細(xì)胞用臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞存活率。

1.2.6 細(xì)胞來源鑒定 酚-氯仿法提取第 11代 SK細(xì)胞全基因組DNA。具體方法如下:0.25胰酶-EDTA消化1瓶第11代SK細(xì)胞,1000r/m離心5min,吸掉上清,加入 1mL預(yù)冷的 PBS(pH7.4)漂洗兩遍,得到的細(xì)胞沉淀加入 300μL細(xì)胞裂解液[10 mmol/L Tris-HCl和10 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA),pH 8.0],56°C孵育1h。細(xì)胞消化液經(jīng)過飽和酚/氯仿-異戊醇抽提,無水酒精沉淀,最后溶解于雙蒸水中。紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度。所得DNA于–20°C保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR擴(kuò)增金錢魚SK細(xì)胞線粒體COI基因的DNA片段(Zhang,2011)。50μL 反應(yīng)體系中,包括 5.0μL 10XPCR buffer,2.0μL dNTP(10mmol/L),33.4μL 去離子水,引物(表1)各 0.25μL(10μmol/L),2.0μL 模板DNA和0.3μL 1.25U Ex Taq DNA聚合酶(Takara)。反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性2min,94°C變性30s,52°C 30s,72°C 40s,30個(gè)循環(huán),最后72°C延伸10min,4°C保存。PCR產(chǎn)物在 1%瓊脂糖膠上檢測(cè)擴(kuò)增條帶,對(duì)目的條帶進(jìn)行回收純化,送至上海美吉生物有限公司測(cè)序。使用BLAST對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.7 腎細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 通過加NaCl和水調(diào)整培養(yǎng)基滲透壓,分別配制濃度為 95、137、200、330、430、550 mmol/kg 的培養(yǎng)基(10% FBS,不含抗生素)。

表1 擴(kuò)增COI基因引物Tab.1 The COI primers

消化第 12代腎細(xì)胞,用等滲培養(yǎng)基充分懸浮細(xì)胞,使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度,按每孔100μL,5000個(gè)細(xì)胞的密度接種到96孔板,分為6組,每組 3個(gè)平行,一個(gè)空白對(duì)照。接種 6h后更換上述培養(yǎng)基。分別孵育24h、48h、96h,每孔加入10μL cck-8液,3h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm波長的吸光值。

1.2.8 腎細(xì)胞最適培養(yǎng)條件的確定 比較不同培養(yǎng)基及血清濃度對(duì)細(xì)胞增殖速率影響的方法同上述腎細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。其中,最適血清濃度更換的培養(yǎng)基分別為含有5%,10%,15%,20%FBS的L-15,培養(yǎng)溫度為28°C。最適培養(yǎng)基更換的培養(yǎng)基分別為MEM、L-15和1640,血清濃度為10%,培養(yǎng)溫度為28°C。

2 結(jié)果

2.1 金錢魚血清滲透壓

采用 VAPRO-5520滲透壓儀測(cè)得金錢魚血清滲透壓為321.1±3.54 mmol/kg。根據(jù)金錢魚滲透壓配制等滲培養(yǎng)基,按照上述配方配制培養(yǎng)基,使用滲透壓儀測(cè)得培養(yǎng)基滲透壓為(323±3.23) mmol/kg。

2.2 原代培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)比較了 bFGF對(duì)原代細(xì)胞增殖的影響,見表2。加入10ng/mL bFGF的原代腎細(xì)胞,第4天開始有細(xì)胞遷出,第7天細(xì)胞鋪滿瓶底80%,原代培養(yǎng)周期為7天,圖1是加入生長因子(bFGF)組腎細(xì)胞向外遷出。不加bFGF的腎細(xì)胞生長較緩慢,第11天有細(xì)胞遷出,14天鋪滿瓶底80%,原代培養(yǎng)時(shí)間長達(dá)14d。結(jié)果表明:添加10ng/mL的bFGF能明顯促進(jìn)腎細(xì)胞的增殖,明顯縮短原代細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)間。

表2 bFGF對(duì)腎細(xì)胞貼壁和增殖的影響Tab.2 bFGF effects on the adherence and proliferation of SK cells

2.3 傳代培養(yǎng)

原代細(xì)胞鋪滿平底 80%開始傳代,首次傳代細(xì)胞按1︰1的比例傳代,即原瓶傳代,此后按1︰2或1︰3比例傳代。傳代細(xì)胞3—4h貼壁,為成纖維樣細(xì)胞(圖1)。傳代細(xì)胞(圖2)生長迅速,3—4d即可傳代。前5代細(xì)胞血清濃度仍為20%,5—10代降至15%,10代后為10%。目前,金錢魚的腎細(xì)胞已傳至22代。

2.4 凍存和復(fù)蘇

復(fù)蘇液氮凍存一年的第7代SK細(xì)胞,臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)得細(xì)胞存活率為 70%,細(xì)胞接種后 6h內(nèi)貼壁,形態(tài)未發(fā)生變化,6天鋪滿單層。

2.5 COI基因序列測(cè)定和比對(duì)分析

擴(kuò)增SK細(xì)胞線粒體COI基因以證明此細(xì)胞系來源。提取第11代SK細(xì)胞全基因組DNA,PCR擴(kuò)增獲得756bp的條帶(圖3)。測(cè)序圖譜中未出現(xiàn)疊峰,表明所擴(kuò)展對(duì)象來源單一。在NCBI上對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)分析,結(jié)果顯示,PCR擴(kuò)增出的片段與GenBank中公布的金錢魚COI片段(EF607516.1)序列相似性為100%,表明SK細(xì)胞來源于金錢魚。

圖1 金錢魚原代培養(yǎng)細(xì)胞Fig.1 Primary culture of SK cells

圖2 金錢魚12代腎細(xì)胞Fig.2 SK cells at 12th generation

圖3 SK細(xì)胞線粒體COI基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.3 COI amplification product for SK cells

2.6 腎細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

腎細(xì)胞在不同的滲透壓條件下(137—430mmol/kg)都可快速增殖(圖4)。3天后,培養(yǎng)基滲透壓為 95、137、200、330、430、550mmol/kg的細(xì)胞的增殖倍數(shù)分別為 0.87、2.29、4.42、3.76、3.09、1.39(增殖倍數(shù)=第3天OD值/第0天OD值)。其中在200mmol/kg的培養(yǎng)基中增殖速率最高,在 430mmol/kg的高滲環(huán)境中細(xì)胞也增殖了兩倍,表明金錢魚腎細(xì)胞可以在較廣的滲透壓范圍條件下生長。

圖4 SK細(xì)胞在不同滲透壓條件下的增殖情況Fig.4 The proliferation rate of SK cells in different osmotic media

2.7 腎細(xì)胞最適培養(yǎng)條件的確定

腎細(xì)胞在不同血清濃度培養(yǎng)基中增殖速率不同,其中在15%和20%FBS的培養(yǎng)基中增殖速度最快,在5%FBS培養(yǎng)基中增殖緩慢(圖5)。

腎細(xì)胞在不同培養(yǎng)基中增殖速率不同,其中在L-15培養(yǎng)基中增殖速度最快,在M199和1640中增殖較慢,說明SK細(xì)胞的最適培養(yǎng)基為L-15(圖6)。

圖5 SK細(xì)胞在不同血清濃度培養(yǎng)基中的增殖情況Fig.5 The proliferation rate of SK cells under different concentrations of fetal bovine serum

3 討論

細(xì)胞系為魚類研究提供了強(qiáng)有力的工具。近年來,我國海水養(yǎng)殖業(yè)日益壯大,海水魚細(xì)胞系的重要性了受到了廣泛的關(guān)注,然而,我國已建立的海水魚類細(xì)胞系還很少(Chenet al,2005;張博等,2010)。本研究首次建立了金錢魚腎細(xì)胞系,為金錢魚免疫學(xué),基因功能學(xué)等方面的研究奠定了基礎(chǔ),同時(shí)豐富了我國海水魚類系資源。

本實(shí)驗(yàn)采用胰酶消化法成功啟動(dòng)了金錢魚腎細(xì)胞的原代培養(yǎng),SK細(xì)胞在含有10%FBS的L-15培養(yǎng)基中穩(wěn)定傳代。SK細(xì)胞為成纖維細(xì)胞,混雜少量的上皮樣細(xì)胞。組織塊法和胰酶消化法是原代培養(yǎng)常用的培養(yǎng)方法。相對(duì)胰酶消化法,組織塊法周期較長。Wazir等(2010)采用組織塊法建立的CCF(鯉魚鰭細(xì)胞)和 CCH(鯉魚心臟細(xì)胞)細(xì)胞系,原代培養(yǎng)周期為 21天。采用此方法的異源四倍體鯽腎細(xì)胞原代培養(yǎng)長達(dá)一個(gè)月(鄧云等,2006)。本實(shí)驗(yàn)采用0.25%胰酶消化法,原代細(xì)胞長滿單層的時(shí)間僅為7天,明顯縮短了培養(yǎng)周期。

圖6 SK細(xì)胞在不同培養(yǎng)基中的增殖情況Fig.6 The proliferation rate of SK cells in different media

魚類常用的培養(yǎng)基包括MEM、L-15和 M199。其中 L-15培養(yǎng)基配方中不含碳酸氫鈉緩沖系統(tǒng),不需要CO2平衡環(huán)境,廣泛地應(yīng)用于魚類細(xì)胞培養(yǎng)。該培養(yǎng)基平衡環(huán)境不需要CO2,降低了細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)環(huán)境的要求,同時(shí)也降低了污染的幾率。鑒于 L-15培養(yǎng)基的諸多優(yōu)點(diǎn),超過 80%的魚類細(xì)胞系選擇該種培養(yǎng)(Zhaoet al,2003;Qinet al,2006;Lakraet al,2011)。在原代細(xì)胞培養(yǎng)時(shí),比較了 DMEM、DMEM-f12及L-153種培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果(數(shù)據(jù)未列出),其中DMEM和DMEM-f12由于需要5%平衡環(huán)境,培養(yǎng)基的pH變化明顯,實(shí)驗(yàn)效果不理想。L-15培養(yǎng)基只需要大氣環(huán)境,因此實(shí)驗(yàn)采用封閉式培養(yǎng),培養(yǎng)基的pH波動(dòng)很小,實(shí)驗(yàn)效果理想。

細(xì)胞培養(yǎng)液在合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上通常需要添加一些天然成分,如血清、生長因子等(樊廷俊等,2007)。血清是培養(yǎng)液中最常見的添加物,一般選用品質(zhì)較好的胎牛血清(曾令兵等,2009)。在一般魚類細(xì)胞培養(yǎng)中添加量為 10%—20%,在此范圍內(nèi),高濃度的血清可以明顯促進(jìn)細(xì)胞貼壁和增殖(魏云波等,2011)。本實(shí)驗(yàn)原代培養(yǎng)采用20%FBS,傳代培養(yǎng)至5代后降至10%。細(xì)胞貼壁較好,增殖迅速,3—4d即可傳代。選用重組人bFGF作為刺激因子,在10ng/mL的濃度下,bFGF可明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖,在第4天細(xì)胞開始遷出,第7天長滿單層,顯著縮短了原代細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)間。魚類細(xì)胞加入bFGF可以顯著提高細(xì)胞的增殖速率。

鑒定細(xì)胞系來源是確保實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性的必要步驟(Waziret al,2010)。本研究擴(kuò)增SK細(xì)胞線粒體COI基因以證明此細(xì)胞系來源。PCR擴(kuò)增出的片段與GenBank中公布的金錢魚COI片段(EF607516.1)序列相似性為 100%,證明 SK細(xì)胞來源于金錢魚。COI基因序列被認(rèn)為是一種物種鑒定的有效標(biāo)記,廣泛應(yīng)用于物種的分類和系統(tǒng)發(fā)育研究(Hebertet al,2003;Hebertet al,2004;Xiaoet al,2004)。Cooper(2007)使用COI基因鑒定了67種細(xì)胞系的來源。Wazir等(2010)的研究結(jié)果也證明了 COI基因作為細(xì)胞系來源鑒定的有效性。本次研究表明SK細(xì)胞COI基因與金錢魚相似度為100%,再次證明了COI基因是細(xì)胞系來源鑒定的重要工具。

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SK細(xì)胞可以耐受137—430mm/kg的滲透壓范圍,具有較強(qiáng)的滲透壓耐受性,對(duì)鹽度的適應(yīng)性廣,符合金錢魚抗逆性強(qiáng)的特性。Sandbichler和 Pelster(2005)指出,體外培養(yǎng)的細(xì)胞例如 RTgill-W1(虹鱒鰓細(xì)胞系),當(dāng)滲透壓發(fā)生顯著的變化時(shí),細(xì)胞內(nèi)表達(dá)一些參與滲透調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白,以保護(hù)細(xì)胞免受外界的傷害。Lee等(2009)證明 RTgill-W1對(duì)滲透壓的耐受力很強(qiáng),可以在175—550mmol/kg的滲透壓范圍內(nèi)生存。本實(shí)驗(yàn)的金錢魚腎細(xì)胞可以在 137—430mm/kg的滲透壓范圍生存,對(duì)滲透壓有較大的耐受性,這一點(diǎn)類似于RTgill-W1細(xì)胞。然而,SK細(xì)胞對(duì)低滲環(huán)境的耐受性更強(qiáng),而高滲環(huán)境對(duì)細(xì)胞的傷害較大。其中,SK細(xì)胞在 200mmol/kg的低滲環(huán)境中增殖最快,這可能是由于SK細(xì)胞在低滲環(huán)境中啟動(dòng)了某種機(jī)刺激細(xì)胞的增殖,有待進(jìn)一步研究。

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