吳志昊 尤 鋒① 宋宗誠 胡金偉, 王麗娟 朱香萍 譚訓(xùn)剛 李 軍

(1.中國科學(xué)院海洋研究所實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266071;2.威海圣航水產(chǎn)科技有限公司 威海 264200;3.中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049;4.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 青島 266109)

大菱鲆(Scophthalmus maximus)屬于菱鲆科(Scophthalmidae)、菱鲆屬(Scophthalmus)(Nelson,2006),原產(chǎn)于歐洲北海、波羅的海和地中海沿岸,自 1992年由黃海水產(chǎn)研究所引入我國,已成為我國北方主要的海水養(yǎng)殖品種。但是,近年來大菱鲆由于累代養(yǎng)殖和近親交配,造成孵化率、成活率下降,生長慢,抗逆性差等現(xiàn)象不斷發(fā)生(馬愛軍等,2010)。因此,采取有效方法對大菱鲆進(jìn)行遺傳改良,從根本上解決大菱鲆養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)良種化問題已成當(dāng)務(wù)之急。

多倍體作為細(xì)胞工程育種的重要組成部分,一直受到研究者和養(yǎng)殖業(yè)者的關(guān)注,特別是不育的三倍體生物可將用于繁殖的能量轉(zhuǎn)化到生長方面,避免了性腺發(fā)育和成熟繁殖階段生長停滯、肉質(zhì)下降和死亡率增高等現(xiàn)象,因而具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值(劉筠等,2003)。以大菱鲆為例,超過1齡的三倍體個(gè)體生長顯著快于二倍體個(gè)體(P＜0.05)。而且由于沒有因性成熟、產(chǎn)卵產(chǎn)精帶來的傷害,成熟三倍體個(gè)體的成活率比二倍體對照要高8%(Calet al,2006)。但是,三倍體魚因?yàn)榫哂腥兹旧w,不能進(jìn)行正常的減數(shù)分裂而達(dá)不到性成熟,因此三倍體每代都需要進(jìn)行人工誘導(dǎo),既繁瑣,成功率又不高,制約了三倍體的大規(guī)模應(yīng)用。而四倍體的生殖細(xì)胞由于含有偶數(shù)染色體組是可育的,成熟的四倍體與正常的二倍體雜交則可進(jìn)行大批量的、一勞永逸的三倍體生產(chǎn),故四倍體的研究一直受到重視(尤鋒,1999)。20世紀(jì)80年代以來,通過染色體組調(diào)控技術(shù)誘導(dǎo)四倍體,在魚類遺傳育種領(lǐng)域已得到廣泛的應(yīng)用,并在虹鱒(Salmo gairdneri)(Chourrout,1982)、斑點(diǎn)叉尾(Ictalurus punctatus)(Bidwellet al,1985)、羅非魚(Oreochromis niloticus和O.mossambicus)(Myers,1986)、鳙魚(Anstichthys nobilis)(洪云漢,1990)、水晶彩鯽(Carassius auratustransparent colored variety)(桂建芳等,1991)等魚類中進(jìn)行了應(yīng)用。但在海水魚類中僅在歐鱸(Dicentrarbus labrax)(Peruzziet al,2003)、黃金鱸(Perca flavescens)(Malisonet al,1993)、半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)(李文龍等,2012)和牙鲆(Paralichthys olivaceus)(衣啟麟等,2012)中有一些嘗試。到目前為止,有關(guān)大菱鲆四倍體的人工誘導(dǎo),國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究探索了靜水壓誘導(dǎo)大菱鲆四倍體受精卵染色體加倍的條件,并獲得了高誘導(dǎo)率的大菱鲆初孵仔魚,其結(jié)果將為大菱鲆四倍體成魚的獲得以及進(jìn)一步三倍體規(guī)?；a(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究所用大菱鲆親魚均來自威海圣航水產(chǎn)有限公司,雌魚全長 40—60cm,雄魚全長 35—50cm。親魚在產(chǎn)卵季節(jié)前進(jìn)行營養(yǎng)強(qiáng)化,并通過控光、控溫等方法進(jìn)行生殖調(diào)控。親魚成熟后,選擇體型正常,性腺發(fā)育良好的同批親魚,人工收集質(zhì)量較好的精卵進(jìn)行人工授精。授精及后續(xù)孵育過程水溫保持在14.8—15.5°C之間的恒定溫度下。各組實(shí)驗(yàn)均有二倍體對照,并進(jìn)行4次重復(fù)。

1.2 靜水壓適宜處理時(shí)刻的篩選

根據(jù)預(yù)備實(shí)驗(yàn)結(jié)果,設(shè)置5個(gè)處理時(shí)刻梯度,分別為卵裂前 20min、17.5min、15min、12.5min、10min。實(shí)驗(yàn)中,處理壓力為67.5MPa,處理時(shí)間為6min。處理后的受精卵正常孵化,統(tǒng)計(jì)各組受精率、原腸胚成活率、孵化率和誘導(dǎo)率,篩選最適處理起始時(shí)刻。

1.3 靜水壓適宜處理壓力的篩選

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,將處理時(shí)刻定為卵裂前15min,設(shè)置 5個(gè)處理壓力梯度,分別為 62.5MPa、65MPa、67.5MPa、70MPa、72.5MPa。實(shí)驗(yàn)中,處理時(shí)間為6min。處理后的受精卵正常孵化,統(tǒng)計(jì)各組受精率、原腸胚成活率、孵化率和誘導(dǎo)率,篩選最適處理壓力。

1.4 靜水壓適宜處理時(shí)間的篩選

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,將處理時(shí)刻設(shè)定為卵裂前15min,處理壓力設(shè)定為67.5MPa,設(shè)置5個(gè)處理時(shí)間梯度,分別為 4min、5min、6min、7min、8min。處理后的受精卵正常孵化,統(tǒng)計(jì)各組受精率、原腸胚成活率、孵化率和誘導(dǎo)率,篩選最適處理起間。

1.5 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因子實(shí)驗(yàn)篩選結(jié)果,設(shè)計(jì)3×3正交表,進(jìn)行三因子三水平實(shí)驗(yàn),設(shè)置處理時(shí)刻分別為卵裂前20min、15min、10min;處理壓力分別為 62.5MPa、67.5MPa、72.5MPa;處理時(shí)間分別為 4min、6min、8min。處理后的受精卵正常孵化,統(tǒng)計(jì)各組受精率、原腸胚成活率、孵化率和誘導(dǎo)率。

1.6 胚胎及仔魚倍性鑒定

采用染色體制片計(jì)數(shù)和流式細(xì)胞儀檢測DNA相對含量進(jìn)行倍性鑒定。

染色體制片:每誘導(dǎo)組和對照組選取 100—200粒原腸胚中期胚胎,進(jìn)行秋水仙堿處理、0.075mol/L KCl低滲、卡諾氏液(甲醇:冰乙酸=3︰1)固定、滴片、空氣干燥、15%Giemsa染色,獲得的染色體制片在顯微鏡油鏡下觀察和計(jì)數(shù)。每一組隨機(jī)選取30個(gè)以上中期分裂相,計(jì)算其中四倍體分裂相所占比例即為該組誘導(dǎo)率。

流式細(xì)胞儀檢測 DNA相對含量:每誘導(dǎo)組和對照組采取 10尾以上初孵仔魚,分別搗碎、過 260目篩絹、DAPI染色、流式細(xì)胞儀(PARTEC,CCA-Ⅱ)檢測DNA相對含量。將二倍體對照DNA相對含量設(shè)為100,四倍體DNA 相對含量則應(yīng)為200。四倍體檢出個(gè)體數(shù)與總檢測個(gè)體數(shù)比值即為四倍體誘導(dǎo)率。

1.7 數(shù)據(jù)分析

誘導(dǎo)組和對照組每組各取出約 1000粒受精卵,于600mL杯中孵育,計(jì)算受精率、原腸胚成活率、孵化率及誘導(dǎo)率。具體公式如下:

受精率(%) = 發(fā)育到囊胚期受精卵數(shù)/總上浮卵數(shù)×100%

原腸胚成活率(%) = 發(fā)育到原腸胚中期卵數(shù)/上浮卵數(shù)×100%

孵化率(%) = 正常初孵仔魚卵數(shù)/總上浮卵數(shù)×100%

誘導(dǎo)率(%) = 四倍體分裂相數(shù)/總分裂相數(shù)×100% 或四倍體初孵仔魚數(shù)/正常初孵仔魚數(shù)×100%

誘導(dǎo)組與對照組受精率的比例即為相對受精率,同理計(jì)算相對原腸胚成活率及相對孵化率。后文若無特殊說明均為相對受精率、原腸胚成活率及孵化率。

使用 SPSS16.0軟件計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差,并使用Duncan’s多重比較分析差異的顯著性。

2 結(jié)果

2.1 胚胎發(fā)育、仔魚孵化及倍性鑒定

誘導(dǎo)組胚胎形態(tài)與對照組基本一致(圖1),在早期卵裂過程中可觀察到一些分裂不均衡的現(xiàn)象。在15.0—15.5°C孵化時(shí)魚苗約110h破膜,略晚于二倍體對照組(100h左右)。

二倍體大菱鲆染色體數(shù)為 2n=44(Bouzaet al,1994),因此將染色體數(shù)為 88的視為大菱鲆四倍體,計(jì)算大菱鲆四倍體誘導(dǎo)率(圖2)。而流儀測試則是以二倍體為對照,將二倍體對照組峰值設(shè)為 100,如果樣品峰值為200則視為四倍體。流儀倍性測定僅為原腸胚染色體制片結(jié)果進(jìn)行部分驗(yàn)證,結(jié)果顯示兩種方法結(jié)果基本一致,故本文各誘導(dǎo)組四倍體率使用原腸胚期染色體計(jì)數(shù)方法結(jié)果。

圖1 大菱鲆對照組(上)與誘導(dǎo)組(下)的胚胎發(fā)育觀察Fig.1 Embryo development of turbot in control and induction groups

圖2 大菱鲆二倍體對照(左)和人工誘導(dǎo)四倍體(右)的染色體中期分裂相(上,1000×)和流式細(xì)胞儀(下)檢測結(jié)果Fig.2 Chromosome(above,1000×) and histograms of ploidy analysis(below) of turbot in control(left) and induction groups(right)

2.2 單因子實(shí)驗(yàn)結(jié)果

不同處理時(shí)刻、處理壓力和處理時(shí)間對受精率、原腸胚成活率、孵化率及誘導(dǎo)率的影響如圖3。卵裂前12.5min處理的受精率顯著高于其它各組(P＜0.05),其孵化率也相對較高,但卵裂前15min處理時(shí)誘導(dǎo)率較高,綜合考慮選擇卵裂前15min作為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的處理時(shí)刻;67.5MPa處理的受精率、孵化率及誘導(dǎo)率均為幾個(gè)組中較高的,因此認(rèn)為67.5MPa為較適處理壓力;處理時(shí)間各組之間均無顯著差異,但處理6min其誘導(dǎo)率相對較高,因此認(rèn)為6min為較適的處理時(shí)間。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1,結(jié)果顯示,處理時(shí)刻對原腸胚成活率和孵化率有顯著影響(P＜0.05),其中卵裂前15min處理效果最好。處理時(shí)刻對誘導(dǎo)率和孵化率的影響較處理壓力和處理時(shí)間更大(表2)。處理壓力和處理時(shí)間對受精率、原腸胚成活率、孵化率和誘導(dǎo)率影響均不顯著,但處理壓力的影響大于處理時(shí)間。

3 討論

人工誘導(dǎo)多倍體方法包括生物學(xué)、化學(xué)和物理學(xué)方法三大類。其中,生物學(xué)方法主要是通過遠(yuǎn)緣雜交產(chǎn)生三倍體或四倍體后代,如 He等(2012)用紅鯽(♀)與翹嘴鲌(♂)雜交獲得了異源三倍體、四倍體。但這種方法受魚種的限制較大,僅在少數(shù)特定魚種中可獲得成功?；瘜W(xué)法主要是利用秋水仙素(colchicine)和細(xì)胞松弛素B(cytochalasin B,CB)等化學(xué)藥品,抑制第二極體的排出或抑制早期卵裂,從而達(dá)到產(chǎn)生三倍體或四倍體的目的。但化學(xué)藥品具有毒性,在魚類中使用通常得到的是嵌合體,目前應(yīng)用已較少(Chourrout,1984)。物理學(xué)方法主要包括溫度休克法和壓力休克法,是魚類三倍體、四倍體誘導(dǎo)最為常用的方法,操作起來較簡單、在生產(chǎn)實(shí)踐中容易被接受,但四倍體中溫度法誘導(dǎo)率較低。與溫度休克法相比,壓力休克法在魚類四倍體誘導(dǎo)中更加有效。其通過靜水壓機(jī)產(chǎn)生的高靜水壓來抑制受精卵卵裂,達(dá)到染色體加倍的目的,在四倍體誘導(dǎo)中尤其有效。其處理時(shí)間較短,壓力傳導(dǎo)均勻,對受精卵的損傷小,在適宜條件下可以獲得較高的成活率及誘導(dǎo)率(90%—100%),對冷、溫水性魚類都適用而被廣泛采用(Xuet al,2008)。本研究結(jié)果也表明,靜水壓法能夠有效地誘導(dǎo)大菱鲆四倍體。

表1 大菱鲆四倍體人工誘導(dǎo)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of orthogonal experiment in turbot tetraploid induction

表2 大菱鲆四倍體人工誘導(dǎo)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析Tab.2 Analysis of orthogonal experiment in turbot tetraploid induction

圖3 不同處理時(shí)刻(a)、處理壓力(b)和處理時(shí)間(c)對受精卵受精率、原腸胚成活率、孵化率及誘導(dǎo)率的影響Fig.3 Effects of initiation time,treatment pressure and treatment duration on fertility rate,survival rate of gastrula stage,hatching rate and tetraploid rate

靜水壓處理效果主要是受處理時(shí)刻、處理持續(xù)時(shí)間和處理壓力強(qiáng)度三因素的影響。由本文結(jié)果可看出,不同處理時(shí)刻和不同處理壓力下,各誘導(dǎo)組之間的受精率、孵化率和誘導(dǎo)率存在顯著差異(P＜0.05);而不同處理時(shí)間下各誘導(dǎo)組間受精率、孵化率和誘導(dǎo)率差異均不顯著,說明處理時(shí)間實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響較小,而合適處理時(shí)刻和處理壓力的確定更為重要,這也與正交試驗(yàn)的結(jié)果基本一致。靜水壓誘導(dǎo)魚類四倍體是通過抑制受精卵卵裂使受精卵染色體加倍的,其處理時(shí)刻一般在第一次卵裂前,從受精至卵裂的孵育時(shí)間中,受精卵的低同步性、卵裂調(diào)控的復(fù)雜性以及外界的環(huán)境變化,都會對受精卵的發(fā)育造成影響,使得最佳處理時(shí)刻很難確定。若提前處理,則受精卵還未發(fā)育到預(yù)期程度就開始被處理,極大降低了誘導(dǎo)效率;若延后處理,則受精卵已經(jīng)開始卵裂,進(jìn)而影響其對卵裂的抑制效果,導(dǎo)致非整倍體的產(chǎn)生,會導(dǎo)致死亡率的升高(Sakaoet al,2006)。為能準(zhǔn)確的確定處理時(shí)刻,本實(shí)驗(yàn)是根據(jù)易于觀察確定的第一次卵裂痕出現(xiàn)的時(shí)間,并結(jié)合對照組來計(jì)算處理時(shí)刻的。如此,可以減少水溫和氣溫等環(huán)境因素的影響。

到目前為止,成功獲得兩性可育且能自然繁殖的人工誘導(dǎo)四倍體魚的研究在鲆鰈魚類等純海水魚類中還未見報(bào)道。李文龍等(2012)利用靜水壓誘導(dǎo)得到半滑舌鰨的四倍體魚苗,其四倍體率達(dá)到 68.3%;衣啟麟等(2012)通過靜水壓方法誘導(dǎo)四倍體牙鲆,在培育到8—15cm的子代中檢測出13.3%的四倍體,但也遠(yuǎn)未達(dá)到性成熟。本實(shí)驗(yàn)在初孵仔魚中可檢測到超過70%的四倍體,但這些仔魚的死亡率往往較高,并且導(dǎo)致隨著誘導(dǎo)組仔魚的生長發(fā)育,其四倍體率逐漸降低。此外,實(shí)驗(yàn)中也觀察到四倍體誘導(dǎo)組受精卵前期卵裂出現(xiàn)較多卵裂不均衡現(xiàn)象,其卵質(zhì)也遠(yuǎn)低于采用同批精卵受精的二倍體對照組。這與牙鲆同質(zhì)雌核發(fā)育誘導(dǎo)中出現(xiàn)的現(xiàn)象十分相似(Wanget al,2008),作者推測這些現(xiàn)象可能與受精卵分裂異常導(dǎo)致非整倍體的產(chǎn)生有關(guān),抑或是加倍引起隱性致死基因的純合所致,但具體原因尚需進(jìn)一步分析。

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