王 琦 ，岳耀先，洪 宇，謝琰臣，郝洪軍 張賢軍，谷傳凱，高 翔，張 栩，李海峰

重癥肌無(wú)力(myasthenia gravis，MG)是主要由乙酰膽堿受體(AChR)抗體介導(dǎo)細(xì)胞免疫及體液免疫系統(tǒng)共同參與的自身免疫疾病。實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性重癥肌無(wú)力(experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG)研究發(fā)現(xiàn)Th17 細(xì)胞參與MG 發(fā)?。?］。IL-17A 是Th17 細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，其基因位于人類(lèi)第6 號(hào)染色體上。已有研究證實(shí)IL-17A 的濃度與EAMG 的肌無(wú)力嚴(yán)重程度有關(guān)［2］;伴胸腺瘤的MG 患者血清IL-17A 及其mRNA 水平也顯著高于健康對(duì)照組［3］。

本研究通過(guò)對(duì) MG 患者的 IL-17A 基因rs8193037 及rs1974226 位點(diǎn)進(jìn)行分型，探索其與MG 易感性和嚴(yán)重程度的相關(guān)性。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 納入2007 年11 月～2013 年6 月在青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院及北京友誼醫(yī)院診治隨訪(fǎng)的MG 患者480 例，患者間無(wú)親緣關(guān)系，符合MG 的診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］。對(duì)照組隨機(jī)選取同地區(qū)健康查體人員487 例，均為中國(guó)北方漢族人口，與患者無(wú)親緣關(guān)系，排除慢性感染性疾病及自身免疫疾病。本研究獲得各自醫(yī)院的倫理委員會(huì)同意，納入的MG患者均知情同意。納入的患者每年至少隨訪(fǎng)兩次，并在病情加重時(shí)及調(diào)整治療后2～3 個(gè)月內(nèi)均有隨訪(fǎng)。MG 組按發(fā)病年齡［5］、合并胸腺瘤與否(胸腺CT 及/或胸腺病理證實(shí))、AChR 抗體、首發(fā)受累范圍(眼肌型/全身型)、發(fā)病后兩年間最重受累范圍及最重時(shí)嚴(yán)重程度(Oosterhuis 評(píng)分)［6］，分成亞組。自然史研究發(fā)現(xiàn)82%的MG 患者發(fā)病2 y 內(nèi)發(fā)展到疾病最嚴(yán)重程度［7］，故我們對(duì)病程2 y 以上且資料充分者，分析其最重時(shí)的受累范圍和Oosterhuis 評(píng)分。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)方法 選取位于6 號(hào)染色體5’端啟動(dòng)子調(diào)節(jié)區(qū)的rs8193037 位點(diǎn)及3’端轉(zhuǎn)錄非翻譯區(qū)的rs1974226 位點(diǎn)［8，9］，兩位點(diǎn)在中國(guó)人群中最小等位基因頻率(MAF)均≥0.05(Hapmap，CHB 數(shù)據(jù)庫(kù))。采用上海天昊生物科技有限公司SNPscanTM技術(shù)進(jìn)行基因分型［10］。隨機(jī)選取4%的樣本進(jìn)行雙盲質(zhì)控，質(zhì)控結(jié)果與原分型結(jié)果一致。

1.2.2 統(tǒng)計(jì)方法 采用χ2檢驗(yàn)或Fisher 精確檢驗(yàn)比較MG 組與對(duì)照組、各MG 亞組與對(duì)照組及MG 亞組間等位基因頻率的差異(SPSS17.0 軟件，P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。使用在線(xiàn)軟件SNPstats 進(jìn)行對(duì)照組的Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗(yàn)，在共顯性與加性遺傳模型下比較MG 組與對(duì)照組、各MG 亞組與對(duì)照組以及MG 亞組間基因型頻率的差異，并使用SNPstats 內(nèi)置的Logistic 回歸程序在共顯性與加性遺傳模型下帶入性別、發(fā)病年齡、胸腺情況、AChR 抗體和首發(fā)受累范圍等因素進(jìn)行校正。使用Haploview 4.2 軟件進(jìn)行連鎖不平衡分析。使用PGA 軟件(http://dceg.cancer.gov/tools/analysis/pga)計(jì)算統(tǒng)計(jì)效力。

2 結(jié)果

2.1 MG 組與對(duì)照組一般資料 480 例MG 患者中男189 例，女291 例;發(fā)病年齡1～86 歲(中位數(shù)40 歲，四分位間距32 歲)，＜15 歲者71 例，15～50 歲者253 例，＞50 歲者156 例;胸腺瘤者107 例，不伴胸腺瘤者367 例，無(wú)資料者6 例;AChR 抗體陽(yáng)性者338 例，陰性者124 例，無(wú)資料者18 例。發(fā)病時(shí)為眼肌型者342 例，全身型者135 例，無(wú)資料者3例。MG 組患者總病程8～220 個(gè)月(中位數(shù)43 個(gè)月，四分位間距61 個(gè)月)，每年平均隨訪(fǎng)6.5 次。有發(fā)病后2 y 間最嚴(yán)重時(shí)受累范圍資料者425 例，眼肌型151 例，全身型274 例;有發(fā)病后2 y 間最嚴(yán)重時(shí)Oosterhuis 評(píng)分資料者370 例，0～2 分者216 例，3～5 分者154 例。對(duì)照組共487 例，其中男249 例，女238 例，年齡14～78 歲(中位數(shù)45 歲，四分位間距24 歲)。rs8193037 及rs1974226 位點(diǎn)分型成功率分別為98.55%和99.17%。對(duì)照組基因型分布均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡。

2.2 MG 整組及亞組與對(duì)照組比較 MG 整組與對(duì)照組兩位點(diǎn)的等位基因頻率和共顯性及加性模型下的基因型頻率均無(wú)顯著性差異(P ＞0.05，見(jiàn)表1)。亞組比較:rs8193037 位點(diǎn)的等位基因頻率和共顯性及加性模型下的基因型頻率在根據(jù)發(fā)病年齡、胸腺情況、抗體、首發(fā)受累范圍、2 y 間最重受累范圍和最重時(shí)Oosterhuis 評(píng)分劃分的各亞組間及各亞組與對(duì)照組比較均無(wú)顯著性差異。rs1974226 位點(diǎn)15～50 歲亞組T 等位基因頻率顯著低于＞50 歲亞組(P=0.007，OR=0.411，95% CI 0.217～0.778)，基因型頻率在共顯性及加性模型下有顯著差異(P=0.016 和P=0.0054)，采用logistic 回歸在共顯性及加性模型下校正性別、胸腺情況、抗體和首發(fā)受累范圍等特征后仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.023 及P=0.0089)。＜15 歲亞組與15～50 歲和＞50 歲亞組的比較以及各年齡亞組與對(duì)照組的比較，等位基因和基因型頻率均無(wú)顯著性差異(P ＞0.05，見(jiàn)表2)。在等位基因頻率比較實(shí)際獲得的OR 值為0.411 且顯著性水平為0.05 時(shí)，15～50 歲和＞50 歲亞組比較的統(tǒng)計(jì)效力為44%。rs8193037 位點(diǎn)的等位基因頻率和共顯性及加性模型下的基因型頻率在其余亞組間及各亞組與對(duì)照組間均無(wú)顯著性差異(P ＞0.05，見(jiàn)表2)。

2.3 連鎖不平衡分析 MG 組與對(duì)照組總體，rs8193037 與rs1974226 的連鎖不平衡參數(shù)D’=0.79，r2=0.07，提示兩位點(diǎn)連鎖不平衡程度較低。

表1 rs8193037 及rs1974226 位點(diǎn)與MG 整組相關(guān)性分析

表2 rs8193037 及rs1974226 位點(diǎn)與MG 亞組相關(guān)性分析［例數(shù)(%)］

3 討論

Th17 細(xì)胞是一類(lèi)獨(dú)立的CD4+T 細(xì)胞亞群，主要分泌細(xì)胞因子IL-17A，參與自身免疫反應(yīng)、過(guò)敏反應(yīng)、腫瘤免疫以及對(duì)抗細(xì)菌和真菌感染的宿主防御反應(yīng)［11］。Th17 細(xì)胞在MG 的研究起源于干擾素γ缺陷鼠仍可發(fā)生EAMG 的報(bào)道［1］。Wang 等［2］進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)IL-17A 水平與EAMG 動(dòng)物的肌無(wú)力嚴(yán)重程度相關(guān)。已有研究證實(shí)IL-17A 基因多態(tài)性與中國(guó)人群炎癥性腸?。?］及自身免疫性甲狀腺炎［8］相關(guān)，但I(xiàn)L-17A 基因多態(tài)性與MG 的易感性和嚴(yán)重程度的關(guān)系尚無(wú)報(bào)道。本研究選取的 rs8193037 及rs1974226 位點(diǎn)分別位于人類(lèi)6 號(hào)染色體5’端啟動(dòng)子調(diào)節(jié)區(qū)及3’端轉(zhuǎn)錄非翻譯區(qū)。啟動(dòng)子能夠控制基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的起始和程度，而轉(zhuǎn)錄非翻譯區(qū)影響mRNA 的剪切和穩(wěn)定性，兩個(gè)位點(diǎn)發(fā)生變異可能會(huì)影響IL-17A 基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響IL-17A 的濃度和功能。本研究的分型成功率＞98.5%，對(duì)照組中兩位點(diǎn)的基因型和等位基因分布均符合Hardy-wenberg 平衡。兩位點(diǎn)基因型頻率與Pubmed 基因數(shù)據(jù)庫(kù)中中國(guó)漢族人群的數(shù)據(jù)相近。兩位點(diǎn)連鎖不平衡程度低，也與Hapmap 數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)一致。我們對(duì)性別、發(fā)病年齡、胸腺情況、AChR 抗體和首發(fā)受累范圍的亞組分析有助于支持MG 整組易感性分析的可靠性并探索關(guān)聯(lián)性更高的臨床特征;而2 y 間受累范圍和最重時(shí)Oosterhuis 評(píng)分亞組在一定程度上反映了MG 的嚴(yán)重程度。

rs8193037 位點(diǎn)的等位基因頻率和共顯性及加性模型下的基因型頻率在MG 整組、各亞組與對(duì)照組比較以及各亞組之間比較均無(wú)顯著性差異，提示該位點(diǎn)的多態(tài)性與MG 的易感性和嚴(yán)重程度無(wú)關(guān)。而rs1974226 位點(diǎn)的等位基因頻率和共顯性及加性模型下的基因型頻率在MG 整組與對(duì)照組無(wú)顯著性差異，僅兩個(gè)年齡亞組比較等位基因和基因型頻率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其余各亞組與對(duì)照組比較以及各亞組間比較均無(wú)顯著性差異。針對(duì)顯著性差異的亞組，采用logistic 回歸對(duì)潛在的混雜因素(性別、發(fā)病年齡、胸腺情況、AChR 抗體、首發(fā)受累范圍)進(jìn)行校正發(fā)現(xiàn)仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但僅局限在這兩個(gè)年齡亞組之間。但這兩個(gè)亞組等位基因差異的統(tǒng)計(jì)效力僅有44%，故認(rèn)為該差異可能因亞組分析樣本量不足所致，且整組中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，故不認(rèn)為rs1974226位點(diǎn)與MG 的易感性和嚴(yán)重程度有關(guān)。

Mu 等［12］報(bào)道EAMG 存在Th1、Th2、Treg 及Th17 細(xì)胞比例的失調(diào)。Th17 細(xì)胞及IL-17A 在病程早期(致敏后14 d)水平變化不大，但病程晚期(致敏后42 d)顯著增高，且IL-17 對(duì)AChR 特異性T 細(xì)胞和分泌抗AChR 抗體的B 細(xì)胞的促進(jìn)作用僅見(jiàn)于病程晚期，提示IL-17A 在MG 發(fā)病后維持和加強(qiáng)AChR 特異性免疫反應(yīng)，從而影響MG 的嚴(yán)重程度。陸珺等［13］比較了93 例MG 患者與34 例健康對(duì)照者血清IL-17A 水平，未發(fā)現(xiàn)顯著性差異。Roche 等［14］報(bào)道全身型MG 患者血清IL-17A 水平高于健康對(duì)照，但主要由2 例伴胸腺異常者所致，眼肌型MG 患者與對(duì)照并無(wú)顯著性差異。我們對(duì)69 例未治療的MG 患者的研究發(fā)現(xiàn)血清IL-17A 水平與反映嚴(yán)重程度的QMG 評(píng)分正相關(guān)，但此研究中QMG 評(píng)分反映的嚴(yán)重程度為采集標(biāo)本時(shí)的嚴(yán)重程度，與本研究中病程2 y 間最重嚴(yán)重程度不同。

綜上所述，本研究未發(fā)現(xiàn)IL-17A 基因rs8193037及rs1974226 位點(diǎn)基因多態(tài)性與MG 的易感性和嚴(yán)重程度有關(guān)。本研究的結(jié)果還需要其他獨(dú)立樣本的研究或匯總分析來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證。IL-17A 在MG 發(fā)病機(jī)制中的作用還需要結(jié)合MG 表型以及IL-17A 的遺傳學(xué)、免疫學(xué)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究來(lái)進(jìn)一步闡釋。

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