林 達，陳敬寅，李建儒，陳 高

顱內(nèi)動脈瘤破裂所致的蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)的發(fā)生率大約為1/10，000，具有高死亡率和高致殘率的特點［1］。最新的研究表明，蛛網(wǎng)膜下腔出血后的早期腦損傷(early brain injury，EBI)可能是導(dǎo)致蛛網(wǎng)膜下腔出血患者死亡率高的因素之一。其可能的機制包括腦血流量的降低、血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)的破壞以及腦水腫［2］。

同時目前的研究也表明神經(jīng)元細胞的凋亡也是早期腦損傷的一個重要因素并且是決定該疾病短期以及長期預(yù)后，特別是認(rèn)知功能預(yù)后的一個重要因素［3，4］。因此，減輕蛛網(wǎng)膜下腔出血后的早期腦損傷可以有效地降低遲發(fā)的缺血性損傷的嚴(yán)重程度，改善蛛網(wǎng)膜下腔出血患者的神經(jīng)預(yù)后。褪黑素(N-乙酰-5-氧基色胺)由松果體分泌，具有強烈的抗氧化作用，其可能的作用機制為褪黑素及其代謝物可以清除氧自由基，激活抗氧化酶，促進谷胱甘肽的合成，促進其他抗氧化劑的活化，并且可以保護抗氧化酶，所以是非常有效的抗氧化劑［5～8］。而且褪黑素能夠透過血腦屏障，即使大劑量應(yīng)用也并未監(jiān)測到毒性損傷［9，10］。盡管如此，褪黑素對蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷的作用仍沒有明確。

本研究擬觀察褪黑素是否能通過抑制細胞凋亡和穩(wěn)定血腦屏障來減輕蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷和神經(jīng)功能的改善。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物和分組 體重300～330 g 的SD成年雄性大鼠購自Slac 動物實驗有限公司(中國上海)。大鼠隨機分為3 組，即假手術(shù)組(假手術(shù)+溶劑)、SAH 組(SAH+溶劑)、SAH+MEL 組(SAH+褪黑素)。這項研究所有的終點都設(shè)定在蛛網(wǎng)膜下腔出血模型建立后24 h。所有實驗的內(nèi)容均得到了浙江大學(xué)實驗動物倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型 我們依照文獻［11］介紹的方法建立大鼠的蛛網(wǎng)膜下腔出血模型。通過腹腔內(nèi)注射戊巴比妥(40 mg/kg)對大鼠實施麻醉，快速暴露左側(cè)頸總動脈及其分支。從遠端切斷左側(cè)頸外動脈，使由此產(chǎn)生的斷端與頸內(nèi)動脈成一直線。將一根鈍頭的4-0 單絲尼龍縫線通過頸外動脈斷端伸入頸內(nèi)動脈，超過頸內(nèi)頸外動脈分叉處約18～20 mm，直到有阻力感。繼續(xù)將單絲尼龍縫線推進約3 mm，即在靠近頸內(nèi)動脈顱內(nèi)分叉處刺穿頸內(nèi)動脈。大約15 s 后退出單絲尼龍縫線。我們依據(jù)文獻公布的分級量表［12］來評價大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血的嚴(yán)重程度，對6 段基底池蛛網(wǎng)膜下腔的血液量做分級。0 分，沒有蛛網(wǎng)膜下腔出血;1 分，極少量蛛網(wǎng)膜下腔出血;2 分，中等量血并可見動脈;3分，血凝塊覆蓋了分段區(qū)域內(nèi)的所有動脈。通過對6 個分段區(qū)域的分?jǐn)?shù)相加可以得到該蛛網(wǎng)膜下腔出血模型的得分(0～18)。

1.3 藥物治療 褪黑素購自Sigma-Aldrich 公司(圣路易斯，密蘇里州，美國)。把褪黑素(150 mg/kg)溶解于含1%乙醇的生理鹽水溶劑中，在蛛網(wǎng)膜下腔出血2 h 后注射入SAH+MEL 組大鼠腹腔內(nèi)。假手術(shù)組和SAH 組均在對應(yīng)的相同時間點按體重注射等量的溶劑。

1.4 死亡率和神經(jīng)功能障礙的評估 在蛛網(wǎng)膜下腔出血模型建立后24 h，進行死亡率和神經(jīng)功能障礙評估。神經(jīng)功能評分依據(jù)加西亞評分系統(tǒng)［13］。對大鼠的自發(fā)性活動、四肢活動的對稱性、前腳外伸、爬行、軀干本體感覺以及對觸須觸碰的反應(yīng)進行觀察評定，每個測試計0～3 分或1～3 分，總分值范圍從3～18 分。所有測試分值的評定都由對分組及治療情況不知情的觀察者來完成，同時對動物行為測試的順序是隨機的。較低的得分表明存在嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損。在同樣的時間點計算各組大鼠的死亡率。

1.5 腦含水量的測定 在蛛網(wǎng)膜下腔出血24 h后處死大鼠。立即取出腦組織并稱重得到濕的重量，然后在105 ℃情況下烘干24 h 后稱重得到干的重量。通過公式(濕的重量－干的重量)/濕的重量×100%計算得到腦組織的水含量［14］。

1.6 血腦屏障完整性的評價 在蛛網(wǎng)膜下腔出血模型建立后24 h，將2%伊文思藍(5 mg/kg)經(jīng)左側(cè)股靜脈注入大鼠體內(nèi)，并循環(huán)1 h。在深度麻醉后，用磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate-buffered saline，PBS)溶液經(jīng)心室內(nèi)灌注后取腦。將目標(biāo)測定區(qū)域的腦組織稱重后浸潤在3 ml PBS 中制成勻漿，然后15000×g 下離心30 min。取0.7 ml 上液與等體積的三氯乙酸-乙醇(1∶3)混合液混合。經(jīng)4 ℃下孵育過夜后，將樣品于15000×g 下離心30 min，并作激發(fā)光波長620 nm、發(fā)射光波長680 nm 的分光熒光測定。

1.7 組織學(xué)和TUNEL 染色 大鼠處死后用0.1 mmol 磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)和4%多聚甲醛(pH 7.4)注入心臟。取腦放入相同的固定液，置于4 ℃環(huán)境中2 d。然后，將腦置于組織冷凍介質(zhì)中冷凍，并切成7 μm 的切片。TUNEL 染色依據(jù)試劑生產(chǎn)廠家標(biāo)明的方法進行，選取冠狀位相同位置的皮層切片，在400 倍熒光顯微鏡(LSM-710，Zeiss)下觀察拍照并測定相同大腦皮層區(qū)TUNEL 陽性(綠色)細胞數(shù)及細胞核(DAPI，藍色)數(shù)，取TUNEL 陽性細胞數(shù)所占細胞核數(shù)百分?jǐn)?shù)統(tǒng)計分析。

1.8 蛋白質(zhì)印跡 將大鼠處死后用pH 7.4 的PBS 作心內(nèi)灌注，取左側(cè)基底皮質(zhì)樣品(面對血塊)制成勻漿，在4 ℃下以1000×g 離心10 min。將所得上液進一步離心分離，使用CD 蛋白定量試劑(Bio-Rad)測定蛋白濃度。將等量的蛋白(60 μg)重懸于同樣的緩沖液中，95 ℃變性5 min，加入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠作電泳分離。蛋白在80 V 電泳分離3 h 后，于100 V 經(jīng)2 h，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。膜經(jīng)脫脂牛奶封閉后，加入檢測蛋白:一抗caspase-3(1∶1000，sc-22140，Santa Cruz Biotechnology)。膜經(jīng)辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗于21 ℃下孵育1 h 后，使用X 光膠片檢測蛋白條帶，并作定量分析(NIH)。

2 結(jié)果

2.1 生理學(xué)評價 在手術(shù)過程中監(jiān)測的動脈壓、動脈血pH 值、p(O2)、p(CO2)、血糖水平間均沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)(見表1)。

2.2 死亡率、神經(jīng)功能障礙以及蛛網(wǎng)膜下腔出血分級 假手術(shù)組大鼠無死亡，SAH 組死亡率為12/35(33.3%);SAH+MEL 組死亡率為5/28(17.9%)。假手術(shù)組、SAH 組及SAH+MEL 組大鼠神經(jīng)功能評分分別為17.8±0.4、10.9±0.7、12.3±1.2。SAH 組神經(jīng)功能得分顯著低于假手術(shù)組(10.9±0.7 vs 17.8±0.4，P＜0.05)。SAH+MEL 組大鼠的神經(jīng)功能缺損較SAH 組明顯減輕(12.3±1.2 vs 10.9±0.7，P＜0.05)。同時在取腦時發(fā)現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔血凝塊主要分布在同側(cè)的Willis 環(huán)和腦干表面，假手術(shù)組、SAH 組和SAH+MEL組的蛛網(wǎng)膜下腔出血分級分?jǐn)?shù)分別為(0±0)、(13.47±1.5)、(13.45±1.1)。SAH 組與SAH+MEL 組之間的蛛網(wǎng)膜下腔出血評分無顯著性差異。

2.3 褪黑素對腦含水量的影響 蛛網(wǎng)膜下腔出血后24 h，假手術(shù)組大鼠的腦含水量為79.2%;SAH 組大鼠的腦含水量為80.0%;SAH+MEL 組大鼠的腦含水量為79.5%。與假手術(shù)組相比，SAH 組的腦含水量增加0.8%(79.2% vs 80.0%，P＜0.05)。與SAH 組相比，SAH+MEL 組大鼠的腦含水量明顯降低(79.5% vs 80.0%，P＜0.05)。

2.4 褪黑素對血腦屏障的影響 伊文思藍染料外滲是血腦屏障破壞的一項指標(biāo)。蛛網(wǎng)膜下腔出血后24 h，與假手術(shù)組相比，SAH 組大鼠的目標(biāo)測定區(qū)域腦組織伊文思藍滲出明顯增多(P＜0.05)。與SAH 組相比，SAH+MEL 組大鼠目標(biāo)測定區(qū)域腦組織伊文思藍滲出明顯減少(P＜0.05)。

2.5 褪黑素對細胞凋亡的影響 在假手術(shù)組沒有發(fā)現(xiàn)TUNEL 陽性細胞。蛛網(wǎng)膜下腔出血后24 h，SAH 組大鼠的基底部皮質(zhì)可發(fā)現(xiàn)大量TUNEL陽性細胞。與SAH 組相比，褪黑素治療可以明顯減少基底部皮質(zhì)中的TUNEL 陽性細胞(P＜0.05)。

2.6 褪黑素對caspase-3 表達的影響 我們在大鼠左腦基底部皮質(zhì)中檢測caspase-3 的表達。褪黑素可以抑制蛛網(wǎng)膜下腔出血誘導(dǎo)的caspase-3 表達的升高。與SAH 組相比，SAH+MEL 組大鼠左腦基底部皮質(zhì)中的caspase-3 表達水平明顯降低(P＜0.05)。

表1 不同組間生理狀態(tài)比較

3 討論

蛛網(wǎng)膜下腔出血早期腦損傷的機制非常復(fù)雜，涉及顱內(nèi)壓的升高、腦灌注壓的降低、凋亡、壞死、自噬、血腦屏障障礙、氧化應(yīng)激和炎癥等［15］。近期的研究發(fā)現(xiàn)，很多藥物在某一方面對蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期腦損傷有保護作用，然而更多的研究表明，只有那些具有多重保護機制的藥物才能在近期和遠期預(yù)后中能起到較為切實有效的作用。在實驗中，我們研究了褪黑素在早期腦損傷中的作用，并且研究了它對蛛網(wǎng)膜下腔出血后大鼠腦組織細胞凋亡、血腦屏障功能障礙、腦水腫、神經(jīng)功能障礙和死亡率的影響。我們的研究表明，在大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血2 h后腹腔注射褪黑素顯著改善了蛛網(wǎng)膜下腔出血后24 h時的預(yù)后，降低了大鼠的死亡率，改善了大鼠的神經(jīng)功能評分。

在蛛網(wǎng)膜下腔出血的早期，通?？梢杂^察到血腦屏障的破壞、內(nèi)皮細胞功能障礙以及隨后的腦水腫。而繼發(fā)于這些改變的便是顱內(nèi)壓升高、嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙和較高的死亡率［16，17］。在我們的研究中，我們在蛛網(wǎng)膜下腔出血后24 h 也發(fā)現(xiàn)了SAH 組大鼠存在腦水腫和血腦屏障破壞，但通過褪黑素治療可以減輕腦水腫和血腦屏障的破壞程度。

很多研究已經(jīng)確定在動脈瘤蛛網(wǎng)膜下腔出血過程中，神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞都會發(fā)生凋亡［18，19］。我們的結(jié)果表明蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦組織的相關(guān)區(qū)域凋亡水平上升，而通過褪黑素的治療可以降低其上升程度。另外，有證據(jù)表明外源性和內(nèi)源性凋亡機制在蛛網(wǎng)膜下腔出血后的細胞凋亡過程中均被激活［20，21］，蛛網(wǎng)膜下腔出血后的細胞凋亡的分子機制主要涉及caspase-3、caspase-8 以及caspase-9，因而在蛛網(wǎng)膜下腔出血后抑制它們的活性對近期和遠期的預(yù)后均是有益的［11，22，23］。我們的研究表明蛛網(wǎng)膜下腔出血早期褪黑素治療可以降低caspase-3 的表達，從而降低蛛網(wǎng)膜下腔出血后的細胞凋亡水平，改善神經(jīng)功能。

總之，我們的研究表明大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后早期褪黑素治療有降低細胞凋亡水平、減輕腦水腫和保護血腦屏障的作用，并可能通過上述作用減輕蛛網(wǎng)膜下腔出血后的早期腦損傷，降低蛛網(wǎng)膜下腔出血的死亡率，改善神經(jīng)功能。但是褪黑素降低細胞凋亡和保護血腦屏障的機制尚不明確，需要進一步的實驗去探索研究。

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