馬 霞，劉永錄，郭振環(huán)，沈志強(qiáng)

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，河南 鄭州450011；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州256600）

豬細(xì)小病毒（Porcine ParvovirusVaccine，PPV）病是引起母豬繁殖障礙的主要病因之一，為了預(yù)防豬細(xì)小病毒病，上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所在國內(nèi)首先研制成功豬細(xì)小病毒病滅活疫苗[1]，并證實(shí)豚鼠可以作為豬細(xì)小病毒病疫苗效力檢驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)動物[2]，豚鼠免疫油佐劑細(xì)小病毒疫苗后具有免疫效果確實(shí)[3]的優(yōu)點(diǎn)。國外在用豚鼠和家兔作為疫苗的效力檢驗(yàn)方面也做過探討[4]。

本試驗(yàn)以豚鼠為模型動物，以油佐劑和鋁膠佐劑為對照，觀察蜂膠對豬細(xì)小病毒滅活疫苗的佐劑作用。

1 材料與方法

1.1 蜂膠佐劑的制備 將生產(chǎn)用蜂膠（購自山東省聊城蜂業(yè)研究所，蜂膠在75%乙醇溶解率≧65%），在2℃～8℃條件下磨碎過篩，按1∶4（W/V）比例加入95%乙醇，室溫浸泡48 h，冷卻、過濾，即得純凈蜂膠乙醇浸出液（透明栗色溶液）。

1.2 主要試劑和儀器 主要試劑：RPMI1640培養(yǎng)液，Gibco公司產(chǎn)品；按說明書用三蒸水配制后過濾除菌，分裝，4℃保存；伴刀豆素球蛋白（ConA），Sigma公司產(chǎn)品；-20℃保存；Hank's試劑按照文獻(xiàn)[5]配制；小牛血清：杭州四季青生物有限公司產(chǎn)品；56℃30min滅活，分裝，-20℃保存?zhèn)溆茫凰倪螓}（MTT）：3-（4，6-二甲基噻唑-2-x-l）-2，5-乙苯基-四唑溴鹽，Sigma公司產(chǎn)品。其他試劑皆為分析純。ELISA檢測試劑盒，R&D Systems Inc，Minneapolis，USA.

主要儀器設(shè)備：MULTISKAN-MK3型酶聯(lián)免疫檢測儀，賽默飛世爾（上海）儀器有限公司產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱，美國Revco公司生產(chǎn)；XSZ-D2型倒置顯微鏡，重慶光學(xué)儀器廠生產(chǎn)；75-2A型微量振蕩器，上海醫(yī)用分析儀器廠生產(chǎn)；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板和6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，德國Nunclon公司生產(chǎn)。

1.3 PPV疫苗的制備

1.3.1 病毒接種及收毒 PPV-SD1毒株，山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院分離、鑒定后保存。豬的腎原傳代細(xì)胞（Porcine kidney 15，PK-15），中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。按照常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法[6]，用含有8%新生牛血清的DMEM液（pH=7.2）作為PK-15細(xì)胞的培養(yǎng)液，用0.25%胰酶消化傳代，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。PK-15細(xì)胞生長至12～15 h時(shí)，按照5%接種量接種PPV，待細(xì)胞有80%發(fā)生細(xì)胞病變時(shí)收毒。并用豚鼠紅細(xì)胞血凝試驗(yàn)測血凝效價(jià)[7]，并測定病毒含量[8]。

1.3.2 病毒的滅活 0.3%甲醛在37℃條件下作用24 h，并不斷攪拌。滅活病毒用PK-15細(xì)胞連續(xù)傳代3次，觀察細(xì)胞有無病變確定病毒滅活是否完全。并按《中華人民共和國獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2000版）附錄中方法進(jìn)行無菌檢驗(yàn)。

1.3.3 蜂膠佐劑疫苗的制備 取滅活后PPV加入一定比例蜂膠乙醇提取液，用膠體磨慢速轉(zhuǎn)動攪拌，3 000 r/min攪拌3～5min，使其充分混合乳化。終止攪拌前按總量的0.005%加入10%硫柳汞溶液。

1.3.4 鋁膠疫苗的制備 取滅活后的PPV配以20%氫氧化鋁膠佐劑，按總量的0.005%加入10%硫柳汞溶液。

1.3.5 油佐劑疫苗的制備 94%白油與6%司本-80混合后加2%硬脂酸鋁，滅菌后為油相，滅活后的PPV抗原液加2%吐溫-80為水相，按照油相和水相5∶3比例混合，乳化。乳化時(shí)先緩速混合，再用膠體磨10 000 r/min攪拌20 min。終止攪拌前按總量的0.005%加入10%硫柳汞溶液。

1.4 實(shí)驗(yàn)動物 健康豚鼠，體重350 g左右，購自北京中醫(yī)藥大學(xué)動物中心。飼養(yǎng)于濱州畜牧獸醫(yī)研究院P2動物房（溫度18℃～24℃，24 h光照），籠長×寬×高為80×50×40 cm，每籠2只，定時(shí)用動物房購買豚鼠飼料喂養(yǎng)，自由飲水。試驗(yàn)前檢測HI抗體效價(jià)陰性。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 取豚鼠68只隨機(jī)均分為4組，1～3組分別肌肉注射0.5mL蜂膠佐劑（propolisadjuvant，PA)PPV滅活疫苗、鋁膠佐劑（Aluminum saltadjuvant，AA）PPV滅活疫苗、油佐劑（oilemulsion adjuvant，OA）PPV滅活疫苗0.5mL，空白對照（blank control，BC）組注射0.5mL生理鹽水，2周后二免。分別于免疫后第7（D7）、14（D14）、21（D21）、28（D28）、35（D35）天和第42（D42）天每組5只豚鼠心臟采血0.5mL用β-微量法檢測細(xì)小病毒HI抗體，第D7、D14、D35天每組隨機(jī)抽取3只采集脾臟，分別用MTT法[13]及ELISA法[14]測定脾淋巴細(xì)胞增值及淋巴細(xì)胞上清液中IL-2和IL-4的含量。

1.6 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)以-X±SE表示，用SPSS軟件進(jìn)行Duncan多重分析。

2 結(jié)果

2.1 HI抗體效價(jià)變化 免疫后第7天（D7）和D14蜂膠佐劑組的HI抗體效價(jià)明顯高于鋁膠佐劑和油佐劑組，D21～D42油佐劑組高于蜂膠佐劑組，后者高于鋁膠佐劑組（P＞0.05）；在D28，油佐劑組HI抗體效價(jià)顯著高于蜂膠佐劑和鋁膠佐劑組（P＜0.05）（表1）。

表1 免疫后HI抗體效價(jià)的動態(tài)變化 （log2）

2.2 淋巴細(xì)胞增殖變化 在D7和D35蜂膠佐劑組協(xié)同ConA刺激脾臟T淋巴細(xì)胞增殖A570值顯著高于油佐劑和鋁膠佐劑組，油佐劑組顯著高于鋁膠佐劑組（P＜0.05）。在D14，蜂膠佐劑組A570值顯著高于油佐劑和鋁膠佐劑組（P＜0.05）（表2）。

在D7，蜂膠佐劑組協(xié)同LPS刺激脾臟淋巴細(xì)胞增殖A570值顯著高于油佐劑和鋁膠佐劑組，鋁膠佐劑組顯著高于油佐劑組（P＜0.05）。在D14和D35，蜂膠佐劑組協(xié)同刺激源LPS刺激脾臟淋巴細(xì)胞增殖A570值最高，且高于油佐劑和鋁膠佐劑組（P＞0.05）（表2）。

表2 各組脾臟淋巴細(xì)胞增殖的變化（A570值）

2.3 脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2的變化 在D7，蜂膠佐劑組脾臟T淋巴細(xì)胞分泌IL-2含量顯著高于油佐劑和鋁膠佐劑組，油佐劑組顯著高于鋁膠佐劑組（P＜0.05）。在D14，蜂膠佐劑組分泌IL-2含量顯著高于油佐劑和鋁膠佐劑組（P＜0.05）。在D35，蜂膠佐劑組分泌IL-2含量顯著高于油佐劑和鋁膠佐劑組（P＜0.05）（表3）。

表3 脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2的變化（μg/mL）

2.4 脾淋巴細(xì)胞分泌IL-4的變化 在D7，蜂膠佐劑組和油佐劑組脾臟T淋巴細(xì)胞分泌IL-4含量顯著高于鋁膠佐劑組，三佐劑組含量顯著高于對照組（P＜0.05）。在D14，蜂膠佐劑組脾臟T淋巴細(xì)胞分泌IL-4含量顯著高于油佐劑和鋁膠佐劑組，油佐劑組顯著高于鋁膠佐劑組，三佐劑組含量顯著高于對照組（P＜0.05）。在D35，蜂膠佐劑組脾臟T淋巴細(xì)胞分泌IL-4含量顯著高于油佐劑和鋁膠佐劑組，三佐劑組含量顯著高于對照組（P＜0.05）（表4）。

表4 脾淋巴細(xì)胞分泌IL-4的變化（μg/mL）

3 討論

3.1 對體液免疫的影響 本試驗(yàn)結(jié)果表明，蜂膠佐劑可使豚鼠對豬細(xì)小病毒疫苗取得很好的體液免疫，特別是在免疫早期，血清特異性HI抗體略高于油佐劑組；且在檢測免疫后抗體變化過程中發(fā)現(xiàn)，蜂膠佐劑組抗體效價(jià)高于鋁膠佐劑組。

潘雪珠等[2]和葉向華等[3]已經(jīng)證明，豚鼠可以作為豬細(xì)小病毒油佐劑疫苗免疫的檢測抗體的校檢動物，本試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)豚鼠可以對豬細(xì)小病毒油佐劑疫苗產(chǎn)生很好的體液免疫，蜂膠佐劑豬細(xì)小病毒佐劑疫苗體液免疫水平比油佐劑略差，但優(yōu)于鋁膠佐劑，因此，可以肯定蜂膠佐劑豬細(xì)小病毒疫苗的體液免疫效果。沈志強(qiáng)等首次以蜂膠為佐劑研制的禽霍亂蜂膠菌苗取得了滿意的效果，產(chǎn)生抗體快速、7 d可產(chǎn)生堅(jiān)強(qiáng)免疫力，證明蜂膠在特異性抗體產(chǎn)生早期效果特別明顯[9]。趙恒章等[10]以油佐劑、蜂膠和鋁膠為佐劑，按一定比例配制成巴氏桿菌的滅活苗，試驗(yàn)證明，油佐劑滅活苗的保護(hù)期和蜂膠滅活苗的保護(hù)期相當(dāng)，但蜂膠滅活苗的抗體水平上升速度比油佐劑苗快且保護(hù)率高。

3.2 對細(xì)胞免疫的影響 本試驗(yàn)通過測定淋巴細(xì)胞增殖和IL-2、IL-4細(xì)胞因子含量，比較了蜂膠佐劑、油佐劑和鋁膠佐劑輔助豬細(xì)小病毒滅活疫苗產(chǎn)生免疫應(yīng)答的影響，結(jié)果表明，蜂膠佐劑對疫苗產(chǎn)生細(xì)胞免疫水平高于油佐劑。

IL-2為Th1型細(xì)胞因子，可以增強(qiáng)機(jī)體的抵抗病毒等病原體的能力。IL-4為Th2型細(xì)胞因子，可以輔助機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體。Th1和Th2反應(yīng)相互協(xié)調(diào)[11]。程超等[12]報(bào)道，將蜂膠黃酮作為佐劑制備EDS-76疫苗，研究其對雛雞血液中T、B淋巴細(xì)胞比例的影響，結(jié)果表明，蜂膠黃酮作為佐劑可使雛雞血液中的T淋巴細(xì)胞的比例極顯著增加，且血清特異性抗體增加明顯。也有研究報(bào)道[13]，蜂膠的乙醇粗提物單獨(dú)或配伍其他中藥成分作為新城疫疫苗佐劑使用，與其油佐劑比較，可以產(chǎn)生相同或略低的新城疫抗體，但用MTT法測定的淋巴細(xì)胞增殖效果是蜂膠佐劑優(yōu)于油佐劑，并且可以提高雛雞抵抗新城疫病毒的感染的能力。Fischer G等[14]報(bào)道了用小鼠模型免疫蜂膠的酚類提取物佐劑豬皰疹病毒滅活疫苗的試驗(yàn)，結(jié)果表明，該疫苗可以提高豬皰疹病毒特異性抗體和小鼠脾臟IFN-γ水平。

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