于 淼，何希君，于文會

（1.東北農業(yè)大學動物醫(yī)學學院，黑龍江 哈爾濱150030；2中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江 哈爾濱150001）

對于豬圓環(huán)病毒2型感染的診斷方法，目前有PCR技術、多重PCR、巢式PCR方法、競爭PCR方法、熒光定量PCR、原位雜交技術、DNA芯片技術等檢測技術[1]。本文通過聚合酶鏈反應（PCR）、免疫組織化學(IHC-P)和免疫熒光（IFA）的方法，對送檢病豬樣本進行檢測，及時發(fā)現(xiàn)和淘汰感染豬，減少由PCV引發(fā)的疾病，對降低養(yǎng)豬業(yè)的經濟損失十分必要。

1 臨床癥狀

對57例PCV-2陽性病豬的臨床癥狀統(tǒng)計，消瘦、被毛粗亂是PCV-2相關疾病的主要臨床表現(xiàn)。進行性呼吸困難、皮膚蒼白也是大部分病例的臨床特征。部分豬有皮炎、黃疸、下痢和嗜睡等癥狀。皮炎主要表現(xiàn)為四肢末梢，尤其是后肢有出血斑（見中插彩版圖1）。

2 病理變化

對57例PCV-2陽性病例的剖檢病理變化表明，所有病例都出現(xiàn)淋巴結病變，有不同程度的出血。腎臟出現(xiàn)病變，主要是腎臟腫大、有灰白色斑，部分腎臟出血。脾臟病變，表現(xiàn)為腫大、邊緣出血，也有少部分不腫大、質地變脆。胸腹水和彌漫性肺炎也是觀察到的重要病理變化，部分病例可見肝臟花斑狀條紋，回腸或結腸黏膜充血、淤斑（見中插彩版圖2）。

3 材料與方法

3.1 材料 PCV-2陽性病料由本實驗室鑒定保存；送檢病料：2013年4月-2013年10月的194份臨床病料。其他常規(guī)試劑均為分析純。

3.2 PCR檢測

3.2.1 引物設計 參考GenBank中公開發(fā)表的PCV-2 ORF2的核苷酸序列，設計合成1對引物，片段跨度為整個ORF2，長751 bp。

引物序列如下：PCV-2：Cap1 5′-TTCGGTACCA GCTATGACGTATCCAAG-3′；PCV2：Cap2 5′-GCCAAGCTTTCACTTCGTAATGGTTTT-3′。

3.2.2 用于PCV-2檢測的組織病料DNA的提取豬的淋巴結，加適量滅菌PBS，勻漿后，取300μL用于DNA提取。用Viral DNA/RNA Kit，根據(jù)試劑盒操作說明書提取組織總DNA。

3.2.3 PCR 總體積為30μL，包括2條PCV-2引物（10μLmol/L）各1μL，dNTP（2.5mmol/L）2.0μL，10×Buffer 3μL，Taq酶（5U/μL）0.25μL，模板DNA 3μL，加滅菌雙蒸水20μL，瞬時離心混勻。PCR反應參數(shù)為94℃欲變性5min；94℃45 s，58℃45 s，72℃1min；共35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。取8μL PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，以出現(xiàn)751 bp特異條帶的樣品為陽性。

3.3 免疫組織化學檢測

3.3.1 材料 一抗：Anti-PCV-2 antibody(RTI公司，美國)，1∶100稀釋；二抗：Anti-Mouse IgG-Peroxidase antibody produced in rabbit（Sigma公司，美國），1∶100稀釋。

3.3.2 方法 石蠟切片脫蠟、甲醇內處理、封閉、加一抗、二抗（含HRP標記）、DAB顯色、染核、脫水透明、樹膠封片。

3.4 免疫熒光檢測

3.4.1 材料 一抗：anti-PCV-2 antibody（RTI公司，美國），1∶100稀釋；F4/80macrophage antibody（Dako，丹麥），1∶100稀釋；二抗：FITCHorse Anti-Mouse IgG monoclone antibody（Sigma，美國），1∶200稀釋；Texas Red Horse Anti-Rat IgGmonoclone antibody（Vector公司，瑞士），1∶200稀釋。

3.4.2 熒光染色 石蠟切片脫蠟、高壓、脫脂乳封閉、添加PCV-2一抗和二抗、添加F4/80一抗和二抗、添加DAPI、封片膠封片、激光共聚焦顯微鏡觀察。

4 結果

4.1 PCV-2PCR 檢測結果來自57份樣品中擴增出PCV2特異條帶，與陽性對照擴增結果一致（見圖3）。

圖3 PCV-2 PCR擴增結果

4.2 PCV-2免疫組織化學檢測結果 選取的部位是豬頜下淋巴結，其陽性信號呈黃棕色，主要位于淋巴細胞和巨噬細胞的胞漿中,偶爾出現(xiàn)在細胞核內和上皮細胞中（見中插彩版圖4）。

4.3 PCV-2免疫熒光檢測結果 選取的部位是脾臟，PCV-2陽性信號是綠色（FITC）（見中插彩版圖5）。巨噬細胞陽性信號是紅色（Ts Red）（見中插彩版圖6）。

5 討論

目前，PCV-2及相關疾病已在世界范圍內發(fā)生并廣泛流行，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失[2]。盡管對PCV-2的研究已經有很大的進展，但是其致病機制不是十分明確。PCV-2感染引起機體的免疫抑制，并與其他病原共同感染，加重疾病的危害性，但其具體機制尚不清楚，對于這些問題，我們都必須對病毒在體內和體外細胞中的膚質及其對免疫系統(tǒng)的影響、宿主的抗病病毒免疫反應及病毒蛋白對免疫功能的影響等進行深入研究[3]。

本試驗使用PCR、IHC-P與IFA法檢測PCV-2病毒抗原，其中IHC方法結果顯示，陽性細胞主要位于感染細胞的胞質中，少數(shù)出現(xiàn)在細胞核內。這與唐寧等檢測結果一致[4]。其中Allan等對荷蘭2群豬血清學調查表明，仔豬抗PCV-2母源抗體在出生后8～9周齡消失，在12～15周齡時血清抗體重新出現(xiàn)，說明仔豬在11～13周齡受到PCV-2感染[5]。

PCV-2的剖檢病理變化時肺臟出現(xiàn)非塌陷性、肝色樣變區(qū)或實變，淋巴結腫大，漿膜炎，腎臟有白斑，脾臟腫大或質地變脆以及肝臟和腸道病變[6]。本試驗通過PCR與IHC-P的方法，對豬圓環(huán)病毒進行快速的診斷，免疫組化結果與病理學變化和PCR檢測基本相符。PCR診斷速度快，靈敏度高，成本價高，而免疫組化定位準確，成本低。免疫熒光方法可準確定位各種細胞。在臨床診斷中，如果只是對疾病確診，只需要采用PCR的方法。而如果想確定病毒感染的部位需要免疫組織化學的方法。如果要進一步確定圓環(huán)病毒感染何種細胞，需要采取免疫熒光的方法。

[3] 婁忠子.豬圓環(huán)病毒的分子生物學研究進展[J].中國獸醫(yī)學報，2010，30（6）：862-868.

[4] Kekarainen T，Montoya M，Dominguez J，et al.Porcine circovirus type2（PCV2）viral components immunomodulate recall antigen responses[J].Vet Immunol Immunopathol，2008，124（1-2）：41-49.

[5] 王李輝，趙明軍.豬免疫抑制性疾病致病機制研究進展[J].豬業(yè)科學，2010，4：80-83.

[6]免疫組化法檢測豬圓環(huán)病毒2型在人工感染豬體內的分布[J].畜牧獸醫(yī)學報，2008，39（3）：372-375.

[7]Allan GM，Ellis JA.Porcine circoviruses：a review[J].JVet Diagn Invest，2000，12：3-14.

[8]Rosell C，Segal J，Plana-Dur J，et al.Pathological,immunohistochemical，and in situ hybridization studies of natural cases of post weaningmultisystemic wasting syndrome（PMWS）in pigs[J].JComp Pathol，1999，120：59-78.