李艷玲，劉永錄，于 瑞，張國祖

（1.河南牧業(yè)經濟學院藥物工程系，河南 鄭州450011；2.河南康星藥業(yè)有限公司，河南 中牟451464）

超微粉碎技術是近20年發(fā)展起來的一項跨學科、跨行業(yè)的高新技術，應用這種技術可將固體物料粉碎成直徑小于10μm的粉體。它在中藥制藥行業(yè)的應用雖然起步較晚，但已顯示出獨特的優(yōu)勢和廣闊的應用前景。將它應用于中藥制劑的制備，可大幅度地提高藥材中有效成分的釋放和在體內的吸收[1-2]。到目前為止，關于中藥超微粉的藥動學報道越來越多，但在獸藥領域對于這方面的研究報道還是較少，特別是直接運用到雞個體本身去研究相關的藥動學的更少。

黃連解毒散具有清熱瀉火解毒之功效,在獸醫(yī)臨床上廣泛應用于敗血癥、膿毒血癥、痢疾等各種急性炎癥?；邳S連解毒散在禽病防治中應用的廣泛性，本試驗分別給雞灌服黃連解毒散超微粉和普通粉后，采用HPLC測定黃連解毒散中有效成分小檗堿和梔子苷的在糞便中的含量，以期驗證黃連解毒散經超微粉碎后有效成分在雞體內的變化規(guī)律及其生物利用度，為黃連解毒散超微粉的臨床應用提供借鑒和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材 黃連解毒散由黃連、黃柏、黃芩和梔子按規(guī)定比例混合而成。黃連解毒散普通粉由粉碎機粉碎，過80目篩。黃連解毒散超微粉由河南康星藥業(yè)有限公司采用超微粉碎技術制成，過400目篩。

1.1.2 動物 AA肉雞37日齡。

1.1.3 儀器 Waters液相色譜儀和Waters.2487雙波長UV檢測器（美國Waters公司）；超微粉碎機（開封市同創(chuàng)超細粉體工程技術開發(fā)中心）。

1.1.4 試劑 梔子苷（批號：110749-220714）和小檗堿（批號：110713-200911）標準對照品(由中國藥品生物制品檢定所提供)，甲醇和乙腈為色譜純，水為重蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 樣品的收集 150只雞隨機分為甲、乙、丙3組，每組50只。甲組灌胃給80目的黃連解毒散，2 g/只；乙組灌胃給400目的黃連解毒散，2 g/只，丙組灌胃給400目的黃連解毒散，1 g/只，給藥2.5 h后開始收集糞便，2.5～3.5 h，3.5～4.5 h、4.5～5.5 h、5.5～6.5 h、6.5～7.5 h、7.5～8.5 h、8.5～9.5 h、9.5～10.5 h時間段收集糞便。60℃以下溫度充分干燥，稱重，研細，進行含量測定。

1.2.2 小檗堿的測定

1.2.2.1 色譜條件 色譜柱為XBriageTMC18（4.6mm×250mm），流動相為乙腈-0.1%磷酸水（40∶60），0.1%磷酸水內含0.1%十二烷基磺酸鈉，流速1mL·min，柱溫30℃，波長346 nm。

1.2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取小檗堿對照品適量，加甲醇制成50μg/mL溶液，即得。

1.2.2.3 線性關系考察 精密吸取對照品溶液1mL，加甲醇稀釋到100mL的容量瓶中，制成0.5μg/mL的標準儲備液，精密吸取1、2、5、10、20μL分別進樣，按上述色譜條件測定峰面積，以對照品量為橫坐標，峰面積為縱坐標,計算回歸方程：y=21.973x+28.999，r=0.9999（n=6），說明小檗堿在0.5～25μg/mL呈良好的線性關系。

1.2.2.4 精密度試驗 吸取對照品溶液10μL，重復進樣5次，測定相應的峰面積，RSD為0.032%，說明精密度良好。

1.2.2.5 重復性試驗 稱取同一批樣品5份，按供試品溶液的制備方法處理后，分別進樣10μL，結果RSD為1.72%（n=5）。

1.2.2.6 回收率試驗 分別精密稱取已知含量的樣品5份，精密加入一定量的小檗堿對照品，按超聲波提取方法分別制備供試品，在上述色譜條件下進行測定，計算加樣回收率，結果平均回收率為97.6%，RSD為0.65%。

1.2.2.7 樣品液的制備 稱取干燥的雞糞1 g，精密稱定，置錐形瓶中，加甲醇15mL，超聲30min后，濾入25mL量瓶中，甲醇洗滌錐形瓶和濾液一并濾入量瓶中，定容至刻度，用0.22 nm濾膜過濾，即得。

1.2.2.8 樣品的測定 吸取樣品液10μL進樣，按上述色譜條件測定，見圖1、圖2，計算樣品中小檗堿的含量。結果見表1。

圖1 小檗堿標準品

圖2 小檗堿樣品

表1 雞糞中小檗堿的排出量 （X±SD）

1.2.3 梔子苷的測定

1.2.3.1 色譜條件 色譜柱為大連依利特C18（4.6mm×250mm），流動相為甲醇：水（31∶69），流速為1mL/min，柱溫為30℃，波長為238 nm。

1.2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取梔子苷對照品適量，加甲醇制成90μg/mL溶液，即得。

1.2.3.3 線性關系考察 精密吸取對照品溶液1、2、4、6、8mL于5個10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度。各進樣10μL,按上述色譜條件測定峰面積，以對照品量為橫坐標,峰面積為縱坐標,計算回歸方程為y=20.648x-4.9657，相關系數(shù)r=0.9999．梔子苷在18～180μg/mL呈良好的線性關系。

1.2.3.4 精密度試驗 吸取對照品溶液10μL，連續(xù)進樣5次，測定相應的峰面積，RSD為0.083%，說明精密度良好。

1.2.3.5 重復性試驗 精密稱取同一批樣品5份，按供試品溶液的制備方法處理后，分別進樣10 μL，用外標法計算梔子苷含量，其RSD分別為1.87%（n=5），表明該法重現(xiàn)性良好。

1.2.3.6 加樣回收試驗 分別精密稱取已知含量的樣品5份，精密加入一定量的梔子苷對照品，按超聲波提取方法分別制備供試品，在上述色譜條件下進行測定，計算加樣回收率，結果平均回收率為98.1%，RSD為2.68%，表明該方法可行。

1.2.3.7 樣品液的制備 稱取干燥的雞糞1 g，精密稱定，置錐形瓶中，加甲醇15mL，超聲30min后，濾入25mL量瓶中，甲醇洗滌錐形瓶和濾液一并濾入量瓶中，定容至刻度，用0.22 nm濾膜過濾，即得。

1.2.3.8 樣品的測定 吸取樣品液10μL進樣，按上述色譜條件測定，見圖3、圖4，計算樣品中梔子苷的含量。結果見表2。

圖3 梔子苷標準品

圖4 梔子苷樣品

表2 雞糞中梔子苷的排出量 （X±SD）

2 結果與分析

2.1 超微粉碎對黃連解毒散中小檗堿吸收的影響 表1是雞分別灌服過黃連解毒散的普通粉和超微粉后，測得的不同時間段雞糞中小檗堿的含量。表1結果表明，灌服相同劑量的黃連解毒散，超微粉組和普通粉組相比，雞糞便中小檗堿的量沒有顯著差異（P＞0.05）；當超微粉組的劑量是普通粉劑量的1/2時，雞糞中小檗堿的量也基本減半。說明經過超微粉碎并沒有增加小檗堿在雞體內的吸收。

2.2 超微粉碎對黃連解毒散中梔子苷吸收的影響

表2是雞分別灌服過黃連解毒散的普通粉和超微粉后，測得的不同時間段雞糞中梔子苷的含量。表2結果表明，灌服相同劑量的黃連解毒散，超微粉組和普通粉組相比，超微粉組雞糞中梔子苷的總量明顯減少，兩組相比有顯著差異（P＜0.05），說明經過超微粉碎增加了梔子苷在雞體內的吸收。

3 討論

很多相關報道都證明中藥經過超微粉碎后，其中的有效成分吸收利用度會大大增加，如對扶正解毒散超微粉在感染IBDV的雞體內藥動學研究結果表明，和普通粉相比，扶正解毒散超微粉在雞體內的吸收較快,分布也較快。穿心蓮經超微粉碎后,可顯著提高其有效成分穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯的生物利用度等[4]。

植物藥材經過超微粉碎后，由于細胞破壁，有效成分的溶出理論上應該是增多加快，在動物體內的生物利用度也應該增加。由表1可以看出，小檗堿的排出量甲組和乙組是相當?shù)?，甲組是丙組的2倍，說明經過超微粉碎后并沒有增加小檗堿在體內的吸收利用度。分析其原因，可能是小檗堿由于溶解度不好，在體內的吸收很差，有文獻報道小檗堿在體內的吸收利用度只有2.3%[3]，所以當小檗堿在體內的吸收達到飽和時，即使再增加小檗堿在體內溶出量，也不會被機體所吸收，最后都隨糞便排出。由表2可以看出，梔子苷的排出量甲組是乙組1.44倍、是丙組的3.5倍，說明超微粉碎后梔子苷在體內的吸收利用度大大增加，大約能提高44%。有報道稱梔子苷由于在體內整個腸道都有吸收，具有廣泛的吸收窗，容易吸收[5]，經過超微粉碎后細胞破壁，梔子苷的溶出增加，所以能大幅度增加其生物利用度。

通過本試驗說明，超微粉碎并不是適合于所有的中藥材，對于在體內吸收利用度好的成分經超微粉碎后，能大幅度增加其生物利用度，而對于溶解度差、吸收不好、在體內容易達到飽和的成分，超微粉碎是否有意義有待于進一步研究。

該試驗通過測定雞糞中黃連解毒散有效成分小檗堿、梔子苷的排出量，進而推測小檗堿、梔子苷在雞體內的吸收利用情況，和原來的采血測血藥濃度的方法相比，簡單易行，且避免疼痛使雞產生應激反應而影響成分的吸收，精確度高，具有較高的推廣價值。

[1]關天增，雷敬衛(wèi)，鄭艷麗.淺談超微粉碎[J].中國中藥雜志，2002，27（7）：499-501．

[2]杜軍.超微粉碎-提高獸藥生物利用度的有效方法[J].中國獸藥雜志，2004，38（2）：51-53．

[3]高海鵬，肖飛，馬紅偉，等.鹽酸小檗堿在雞體內的藥動學研究[J].中國獸藥雜志，2009，43（3）：31-34.

[4]韓鳳梅，蔡文濤，夏啟松，等.穿心蓮片中脫水穿心蓮內酯在大鼠血漿中的藥代動力學[J].中華中醫(yī)藥雜志，2005，20（4）：206-209.

[5]杜先華，牛欣，馮前進.梔子苷在大鼠體腸吸收動力學的研究[J].華西藥學雜志，2008，23（5）：558-560.