于永生，曹 陽，羅曉彤，張立春，金海國，王曉陽

(吉林省農(nóng)科院畜牧分院，吉林 公主嶺 136100)

中國是世界上養(yǎng)豬規(guī)模最大的國家，但豬生產(chǎn)水平遠(yuǎn)低于歐美養(yǎng)豬發(fā)達(dá)國家[1]。短期內(nèi)傳統(tǒng)的育種手段很難在豬生產(chǎn)性能方面取得大的進(jìn)展，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物為豬遺傳育種提供了新的技術(shù)手段，可大大加速遺傳改良的速度，尤其是轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞核移植技術(shù)的出現(xiàn)，為轉(zhuǎn)基因技術(shù)在豬改良育種中的應(yīng)用提供了技術(shù)支撐。綠色熒光蛋白（Green-fluorescent protein,GFP）cDNA由 Prasher等在維多利亞水母（Aequorea Victoria）中克隆獲得[2]，該蛋白在一定波長的紫外光下呈現(xiàn)綠色熒光，可作為標(biāo)記蛋白用于生物學(xué)研究，尤其是由于可直觀表現(xiàn)表達(dá)效果，而在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用[3-6]。

表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)基因豬由Park等采用核移植方法在2001年獲取[7]，隨后韓國的2個(gè)實(shí)驗(yàn)室也分別獲取了GFP轉(zhuǎn)基因豬[8-9]。國內(nèi)東北農(nóng)業(yè)大學(xué)劉忠華研究團(tuán)隊(duì)于2007年也獲得了國內(nèi)首批GFP轉(zhuǎn)基因豬[10]。

本文利用組織塊貼壁法獲取豬胎兒成纖維細(xì)胞，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得了表達(dá)綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，為建立利用核移植技術(shù)獲取轉(zhuǎn)基因豬的技術(shù)平臺(tái)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

懷孕35 d的大白豬來源于吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧分院種豬場，手術(shù)法采集子宮，置于37℃PBS中，1 h內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室；熒光蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 豬胎兒成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)

用滅菌剪刀剖開子宮，取出胎兒，利用添加抗生素的37℃ PBS洗滌至少3遍，置于無菌平皿中，去除頭、四肢、內(nèi)臟，將剩余的軀干轉(zhuǎn)移到另外的滅菌安瓿瓶中，利用滅菌眼科剪將組織剪碎至糊狀，將其涂布到細(xì)胞培養(yǎng)皿底部，置于38℃、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中放置4h后，小心加入細(xì)胞培養(yǎng)液（DMEM+10%胎牛血清+1%雙抗+1%非必需氨基酸），盡量避免組織塊漂浮，繼續(xù)以上述條件進(jìn)行培養(yǎng)，每72h換液一次，在第9 d左右成纖維樣細(xì)胞開始從組織塊孵出，利用0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代。

1.3 豬胎兒成纖維細(xì)胞生長曲線測定

用0.25%胰蛋白酶消化傳至第三代的豬胎兒成纖維細(xì)胞，將細(xì)胞懸液與等量0.5%臺(tái)盼藍(lán)混合染色，利用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，利用細(xì)胞培養(yǎng)液將活細(xì)胞濃度調(diào)整為2×104/mL，接種至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種量為0.5 mL，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于38℃、5%CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每24 h利用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)3個(gè)孔中的活細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算平均活細(xì)胞數(shù)，利用Excel繪制生長曲線。

1.4 豬胎兒成纖維細(xì)胞最小致死濃度測定

將傳至第三代的豬胎兒成纖維細(xì)胞按每孔接種2×105細(xì)胞的量接種到24孔板的6個(gè)孔，24 h 后換液,分別用終濃度為 0、200、400、600、800、1000μg/mL的G418進(jìn)行處理,每72h換液1次,培養(yǎng)9 d后所有細(xì)胞均凋亡的G418濃度,就是G418對(duì)豬胎兒成纖維細(xì)胞的最小致死濃度。

1.5 豬胎兒成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

將傳至第三代的豬胎兒成纖維細(xì)胞接種至6孔板中，利用不添加雙抗的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，待生長至80%匯合時(shí)，按照脂質(zhì)體2000說明書的方法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，每孔用脂質(zhì)體10μL，質(zhì)粒4μg。轉(zhuǎn)染18 h后利用含最小致死濃度的G418的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行篩選，每72 h換液一次。

1.6 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的鑒定

篩選9 d后，利用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞是否具有熒光，同時(shí)利用0.25%胰蛋白酶消化部分細(xì)胞，蛋白酶K（150μg/mL）消化后用兩倍體積的無水乙醇（含0.075M的氯化鈉）沉降DNA，利用引物P1和P2，PCR檢測外源基因的整合。引物序列如表1所示。

表1 PCR引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 組織塊法分離培養(yǎng)豬胎兒成纖維細(xì)胞

貼壁的組織塊培養(yǎng)3 d后僅有少量成纖維細(xì)胞從組織塊邊緣游離出，接種9 d后，組織塊周圍即可長出大量成纖維細(xì)胞(圖1A)。利用胰蛋白酶傳代，傳代后的細(xì)胞呈梭形，生長旺盛(圖1B)。

圖1 豬胚胎成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)

2.2 細(xì)胞生長曲線的測定

每天對(duì)24孔板中的3個(gè)孔進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，繪制細(xì)胞生長曲線（圖2），可以發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長趨勢為：細(xì)胞生長滯留期為0～1 d，對(duì)數(shù)生長期為2～4 d，5 d后進(jìn)入平臺(tái)期。

圖2 豬胎兒成纖維細(xì)胞生長曲線圖

2.3 G418對(duì)豬胎兒成纖維細(xì)胞最小致死濃度的確定

以6個(gè)不同濃度的G418處理豬胎兒成纖維細(xì)胞,觀測細(xì)胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)600μg/mL的G418處理9 d后可使豬胎兒成纖維細(xì)胞全部死亡，因此在篩選轉(zhuǎn)基因細(xì)胞時(shí)采用的G418濃度為600μg/mL。

2.4 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的鑒定

對(duì)篩選得到的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞提取DNA，利用PCR對(duì)外源基因的整合進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，可檢測到預(yù)期片段(圖3)，說明外源基因有效整合到細(xì)胞基因組。

圖3 GFP轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和克隆胚胎DNA檢測結(jié)果

在熒光顯微鏡下，可以看到篩選得到的細(xì)胞大多可表達(dá)綠色熒光蛋白（圖4），說明外源基因得到有效表達(dá)。

圖4 GFP轉(zhuǎn)基因豬成纖維細(xì)胞（200x）

3 討論

目前豬胎兒成纖維細(xì)胞的分離主要采用兩種方法：蛋白酶消化法和組織塊法。前者是先用蛋白酶對(duì)組織塊進(jìn)行消化，經(jīng)過篩網(wǎng)過濾后，細(xì)胞懸液接種到細(xì)胞培養(yǎng)皿(瓶)，經(jīng)過3～5 d培養(yǎng)獲得原代細(xì)胞，該方法需要時(shí)間短，但蛋白酶消化程度不好把握，容易對(duì)分離的細(xì)胞增殖造成一定影響；后者是把組織剪碎后接種到培養(yǎng)皿（瓶）壁，當(dāng)組織周圍孵出的細(xì)胞形成單層時(shí)，消化這些單層細(xì)胞即可獲得原代細(xì)胞，該方法獲得的細(xì)胞增殖能力比較穩(wěn)定，但需要的時(shí)間長。綜合考慮利弊，本文采用組織塊貼壁法進(jìn)行豬胎兒成纖維細(xì)胞的分離，通過9 d組織塊貼壁培養(yǎng)，最終獲得了形態(tài)正常的豬原代胎兒成纖維細(xì)胞。傳至第三代，繪制的細(xì)胞生長曲線顯示，接種第一天細(xì)胞處于恢復(fù)期，細(xì)胞數(shù)量有所下降，因?yàn)椴糠旨?xì)胞死亡。從第二天開始細(xì)胞恢復(fù)旺盛的增殖分裂，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，5 d后進(jìn)入平臺(tái)期，細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿，隨后由于細(xì)胞相互接觸，生長受到抑制。該結(jié)果與李仕新等采用酶聯(lián)檢測儀測定OD值法繪制的蛋白酶消化法分離的豬胎兒成纖維細(xì)胞的生長曲線的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致，該研究小組結(jié)果顯示豬胎兒成纖維細(xì)胞于生長初期1～6 d呈對(duì)數(shù)增長，此后進(jìn)入平臺(tái)期，差異可能是由于細(xì)胞分離方法以及生長曲線繪制方法不同而造成[7]。豬胎兒成纖維細(xì)胞的分離為進(jìn)一步的基因轉(zhuǎn)染奠定了基礎(chǔ)。

轉(zhuǎn)基因細(xì)胞一般采用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法、電擊法、鈣沉淀法、病毒介導(dǎo)法進(jìn)行獲取。電擊法往往適用于所轉(zhuǎn)移的片段比較大、細(xì)胞轉(zhuǎn)染率低等情況；鈣離子沉淀法需要對(duì)鈣離子濃度進(jìn)行精密控制，不易操作且實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差；病毒介導(dǎo)法具有轉(zhuǎn)基因效率高的特點(diǎn)，但考慮到安全性，往往在以獲取轉(zhuǎn)基因動(dòng)物為目的的研究中應(yīng)用不多；脂質(zhì)體法主要利用帶正電荷的陽離子脂質(zhì)體與帶負(fù)電荷的DNA片段結(jié)合，進(jìn)而將DNA導(dǎo)入細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層內(nèi)，從而完成轉(zhuǎn)基因，目前脂質(zhì)體法已經(jīng)在豬、牛、羊等動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因方面得到應(yīng)用。綜合考慮上述的轉(zhuǎn)基因方法，本項(xiàng)目采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行基因?qū)耄粗|(zhì)體10μL：熒光蛋白質(zhì)粒4μg的比例對(duì)六孔板中的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，由于熒光蛋白質(zhì)粒上帶有neo基因，一旦整合到細(xì)胞中，可表達(dá)neo蛋白，有效抵抗G418對(duì)細(xì)胞的危害，因此可用G418對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行篩選，經(jīng)過600μg/mL的G418的篩選，最終得到轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，PCR檢測熒光蛋白基因得到有效整合，熒光檢測顯示，所獲取的細(xì)胞大多可表達(dá)綠色熒光蛋白，說明外源基因得到有效表達(dá)，所得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞可以作為生產(chǎn)轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白豬的核移植供體細(xì)胞，為下一步通過核移植方法獲得轉(zhuǎn)基因“熒光豬”奠定了基礎(chǔ)。

[1]熊遠(yuǎn)著 .中國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展道路[J].中國豬業(yè)，2006（4）：1-4.

[2]Prasher DC,Eckenrode VK,Ward WW,et al.Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein[J].Gene,1992,111(2):229-233.

[3]Takada T,Iida K,Awaji T.Selective production of transgenic mice using green fluorescent protein as a marker[J].Nat Biotechnol,1997,15(5):458-461.

[4]Koo BC,Kwon MS,Roh JY,et al.Quantitative analysis of tetracycline-inducible expression of the green fluorescent protein gene in transgenic chickens[J].J Reprod Dev,2012,58(6):672-677.

[5]Lin F,Liu Q,Li M,et al.Transient and stable GFP expression in germ cells by the vasa regulatory sequences from the red seabream (Pagrus major)[J].Int J Biol Sci,2012,8(6):882-890.

[6]Murakami T,Kobayashi E.GFP-transgenic animals for in vivo imaging:rats,rabbits,and pigs[J].Methods Mol Biol,2012(872):177-189.

[7]Park K W,Cheong H T,Lai L,et al.Production of nuclear transfer-derived swine that express the enhanced green fluorescent protein[J].Anim Biotechnol,2001(12):173-181.

[8]Hyun S,Lee G,Kim D,et al.Production of nuclear transfer-derived piglets using porcine fetal fibroblasts transfected with the enhanced green fluorescent protein[J].Biol Reprod,2003(69):1060-1068.

[9]Lee G S,Kim H S,Hyun S H,et al.Production of transgenic cloned piglets from genetically transformed fetal fibroblasts selected by green fluorescent protein [J].Theriogenology,2005(63):973-991.

[10]劉忠華，宋 軍，王振坤，等.體細(xì)胞核移植生產(chǎn)綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因豬[J].科學(xué)通報(bào)，2008，53（5）：556-560.

[11]李仕新，陳松玲，李加琪，等.長大二元雜交豬胎兒成纖維細(xì)胞的生物學(xué)特性 [J].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，30(2):220-225.

[12]李景芬，于 浩，袁 野，等 .同源重組敲除MSTN基因的豬胎兒成纖維細(xì)胞的構(gòu)建 [J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42(8)：2972-2977.

[13]于永生，羅曉彤，張立春，等.牛胎兒成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染線蟲ω-3脂肪酸去飽和酶基因 [J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2011，27（23）：12-16.

[14]王彥鳳，梁 燕，金 永，等 .克隆內(nèi)蒙古白絨山羊胸腺素β4基因并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胎兒成纖維細(xì)胞 [J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43(21)：4497-4504.