金蘭梅，伍清林，喬楠楠，楊 彪，董宏亮，宋二寶

(金陵科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210038)

竹葉在我國(guó)有悠久的利用歷史，是一味傳統(tǒng)的清熱解毒藥。近幾年的研究表明，竹葉中含有大量的黃酮類化合物和生物活性多糖及其他有效成分，如酚酸類化合物、蒽醌類化合物、萜類內(nèi)酯、特種氨基酸和活性肽、錳、鋅、硒等物質(zhì)。竹葉黃酮具有抗衰老、抗應(yīng)激、抗疲勞、調(diào)節(jié)血脂、阻斷亞硝化反應(yīng)、增強(qiáng)免疫能力、抗菌和抑菌等作用[1]。有關(guān)竹葉提取物的抑菌作用已有不少研究報(bào)道，劉曉蓉等[2]研究了淡竹葉提取物的抑菌性能，結(jié)果表明，提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為6.2%， 對(duì)溶血性鏈球菌、綠膿桿菌和大腸桿菌的最低抑菌濃度都是12.5%; 耐熱性好; 抑菌pH值范圍在4～9之間; 具有良好的防腐保鮮效果。鄧騖遠(yuǎn)等[3]采用濾紙片法，測(cè)定毛竹葉與慈竹葉的抑菌作用，得知毛竹葉對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用強(qiáng)，慈竹葉對(duì)大腸桿菌的抑制作用強(qiáng)，慈竹葉的抑菌效力強(qiáng)于毛竹葉。袁國(guó)強(qiáng)等[4]利用有機(jī)溶劑為提取介質(zhì)獲得竹葉提取液，對(duì)食源性細(xì)菌的生長(zhǎng)有較好的抑制作用。賈桂云等[5]應(yīng)用金鑲玉竹葉的乙醇冰醋酸提取物對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，最小抑菌濃度是3.8%，提取物的pH值影響抑菌效果，在酸性、中性條件下抑菌作用比堿性條件強(qiáng)。金蘭梅等[6]應(yīng)用竹葉水提物對(duì)引起畜禽疾病的主要致病菌大腸桿菌和金黃色葡萄球菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，抑菌圈在14～19 mm之間，MIC在1.56～6.25 mg·mL-1之間，MBC在3.125～12.5 mg·mL-1之間。竹葉水提物對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌活性強(qiáng)于對(duì)大腸桿菌的抑菌活性。眾多試驗(yàn)證明，竹葉提取物對(duì)細(xì)菌有明顯的抑制作用。

近年來，在畜禽生產(chǎn)中和獸醫(yī)臨床上大量使用抗生素，動(dòng)物性產(chǎn)品藥物殘留超標(biāo)現(xiàn)象不斷出現(xiàn)，且呈日趨嚴(yán)重的態(tài)勢(shì)。一方面對(duì)消費(fèi)者構(gòu)成危害，威脅人民身體健康；另一方面對(duì)動(dòng)物性產(chǎn)品的正常出口貿(mào)易造成極大障礙。所以國(guó)家對(duì)一些抗生素和生長(zhǎng)促進(jìn)劑在動(dòng)物生產(chǎn)中禁止使用，而把尋找無(低)藥殘、無(低)污染、能替代抗生素的促生長(zhǎng)物質(zhì)的研究作為重點(diǎn)[7]。因此，本試驗(yàn)采集南京幕府山周圍春夏秋冬四季的孝順竹竹葉，用水提法提取有效成分，并從患乳房炎奶牛的乳汁中和患大腸桿菌的病豬體內(nèi)分離出致病性強(qiáng)對(duì)抗生素耐藥的大腸桿菌，對(duì)其進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，比較各季節(jié)竹葉的抑菌效果。為在獸醫(yī)臨床上防治細(xì)菌性疾病，充分利用當(dāng)?shù)刭Y源和進(jìn)一步研制抑菌中草藥產(chǎn)品提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣本來源 竹葉：采集金陵科技學(xué)院幕府校區(qū)校園內(nèi)孝順竹，分別在2012年12月(冬季)、2013年3月(春季)、6月(夏季)、9月(秋季)、每月均在15日14:00-16:00采集。分別選取竹冠上、中、下部健康和已完成展葉的葉片，然后將采集的葉片均勻混合，并用自來水沖洗干凈，放在通風(fēng)處陰干3 d，后放入60 ℃的恒溫箱內(nèi)烘干，粉碎干燥保存。

致病菌性大腸桿菌：豬源從于南京地區(qū)某規(guī)?；i場(chǎng)的患大腸桿菌病死豬的內(nèi)臟分離獲得，牛源從某規(guī)?；膛?chǎng)患乳房炎奶牛乳汁中分離獲得。

1.1.2 培養(yǎng)基、試劑、藥敏紙片 營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NA)、麥康凱瓊脂(MAC)，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)分別為20120115、20120525；營(yíng)養(yǎng)肉湯、伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)、三塘鐵瓊脂(TSI)，腸桿菌科細(xì)菌生化編碼鑒定管GYZ-15e、靛基質(zhì)試劑、頭孢噻肟(CTX)等16種抗生素藥敏紙片均購(gòu)于杭州天和微生物試劑有限公司。質(zhì)控菌大腸埃希氏菌ATCC259購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.3 主要儀器 SW-CJ-2F雙人雙面凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司03091BA)、隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠2080850)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(南京實(shí)驗(yàn)儀器廠DNS-9052BS-III)、立式壓力蒸汽滅菌箱(YXG-LS-75SIDI)、恒溫?fù)u床(KYCC-100)、H-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司生產(chǎn)A01002923)、XA-1 型粉碎機(jī)(江蘇姜堰市分析儀器廠)、顯微鏡等及實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器。

1.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物 普通級(jí)小白鼠，雌雄不限，體重在20～22 g之間，購(gòu)于南京盛民科研實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 致病性大腸桿菌準(zhǔn)備 1) 大腸桿菌分離鑒定。豬源大腸桿菌分離：剖檢病豬，無菌采集心臟、肝臟和脾等病變組織涂于MAC培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h。牛源大腸桿菌分離：無菌采集患乳房炎奶牛的乳汁涂于MAC培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h。

分別取MAC培養(yǎng)基上典型紅色菌落，涂片，革蘭氏染色，鏡檢，初步區(qū)分革蘭氏陽性和陰性，然后做腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定，并轉(zhuǎn)接種于CTX和TSI培養(yǎng)基，觀察反應(yīng)結(jié)果，確認(rèn)大腸桿菌。

2) 致病性試驗(yàn)。將生化反應(yīng)已鑒定為大腸桿菌的菌株接種于普通肉湯， 37 ℃培養(yǎng)18 h。經(jīng)細(xì)菌計(jì)數(shù)用生理鹽水稀釋成1.0×107CFU/mL的菌液，0.5 mL·只-1分別腹腔注射小白鼠，每株做3個(gè)重復(fù)。對(duì)照組小白鼠腹腔注射滅菌生理鹽水0.5 mL·只-1。觀察小白鼠的活動(dòng)及發(fā)病死亡情況，對(duì)發(fā)病死亡小白鼠立即進(jìn)行剖檢，觀察病變，取其寎料涂片、染色、鏡檢，并接種于MAC培養(yǎng)基分離培養(yǎng)。未發(fā)病的繼續(xù)觀察至1周。

3) 抗生素藥敏試驗(yàn)與耐藥菌株的篩選。采用WHO 推薦的Kirby-Bauer法，取頭孢噻肟(CTX)等16種常用的抗生素藥敏紙片對(duì)致病性強(qiáng)的大腸桿菌(豬源、牛源各10株)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。依據(jù)NCCLS有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，每次測(cè)定均以質(zhì)控菌為對(duì)照，只有當(dāng)質(zhì)控菌株的抑菌圈直徑在允許范圍內(nèi)測(cè)試菌株結(jié)果才有效。判定標(biāo)準(zhǔn)參照美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)M100-S15[8]和文獻(xiàn)[9]，以敏感、中介、耐藥3種形式對(duì)抑菌圈大小作出判定。

挑取對(duì)16種抗生素耐藥達(dá)8種以上的菌株，將其接種于5 mL LB培養(yǎng)液中，于37 ℃培養(yǎng)24 h，再用LB溶液將細(xì)菌懸液稀釋至1.0×107CFU/mL，4 ℃冰箱保存、備用。

1.2.2 竹葉有效成分提取 采用水提法，分別稱取不同季節(jié)的干燥竹葉各50 g，加入10倍量水浸泡1.5 h，裝入圓底燒瓶中，放在恒溫電熱套上煎煮，第一次煎以沸騰開始計(jì)算100 ℃煎煮50 min，用8層紗布過濾，濾渣再加100 mL水，第二次煎以70 ℃煎煮30 min。合并兩次濾液，濃縮至50 mL，得濃縮的濃度為1 g·mL-1，調(diào)整pH值至7.0～7.2。分別裝瓶，備用。

將竹葉的提取液加入無水乙醇至醇含量達(dá)到70%(乙醇/混合液=70%)，4 ℃靜置24 h，1 500 r·min-1離心5 min后紗布過濾，所剩溶液加蒸餾水定容至相當(dāng)于生藥1 g·mL-1。灌注封瓶后流通蒸汽消毒滅菌30 min，4 ℃冰箱保存，備用。

1.2.3 竹葉提取物對(duì)大腸桿菌藥敏試驗(yàn) 采用瓊脂打洞法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。將待檢菌液吸取50 uL注入NA培養(yǎng)基中，用玻璃棒充分涂抹均勻，然后用外徑為6 mm 的打孔器在培養(yǎng)基上等距離打孔，吸取融化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂液補(bǔ)底。每孔加1 g·mL-1竹葉的提取液50 uL，在4 ℃冰箱內(nèi)放置30 min 1 h，然后37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈的直徑。 每個(gè)樣本做3個(gè)重復(fù)，以3次平均值為抑菌圈直徑。抑菌圈直徑≥20 mm為極敏，15～20 mm為高敏，10～15 mm為中敏，≤10 mm為低敏[6]。

1.2.4 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測(cè)定 采用試管二倍稀釋法[6]，取滅菌試管11支，每管先加入無菌肉湯1 mL，然后第一管中加入滅菌的受試竹葉提取物1 mL，混勻后取出1 mL放入第2管中，依次類推。直到第9管取出1 mL棄去，配成含竹葉提取物分別為1∶2、1∶4、1∶8、1∶16等各種濃度的液體。第10管不加藥物作為對(duì)照，以便觀察培養(yǎng)基是否適合于細(xì)菌生長(zhǎng)。第11管加受試竹葉提取物1 mL，混勻取出1 mL棄去，不接種細(xì)菌，以便觀察受試中藥是否受污染。

取0.05 mL菌液分別加入上述1～10管中，混勻后放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，觀察結(jié)果。若肉湯混濁，表示細(xì)菌生長(zhǎng);若肉湯完全清亮，表示無細(xì)菌生長(zhǎng)。觀察無菌生長(zhǎng)管所含最低藥物濃度即為最小抑菌濃度(MIC)。

吸取0.1 mL培養(yǎng)物，移種于不含藥的普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂上，涂抹均勻，置37 ℃培養(yǎng)24 h。觀察有無細(xì)菌生長(zhǎng)，以無細(xì)菌生長(zhǎng)的藥物最低濃度作為該藥物的最小殺菌濃度(MBC)。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗生素藥敏試驗(yàn)與耐藥菌株的篩選

選擇致病性強(qiáng)的豬源和牛源的大腸桿菌各10株，應(yīng)用頭孢噻肟(CTX)、頭孢呋辛(CXM)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢吡肟(FEP)、鏈霉素(STR)、慶大霉素(CN)、強(qiáng)力霉素(DO)、阿米卡星(AK)、環(huán)丙沙星(CIP)、氟羅沙星(FO)、左氟沙星(LEV)、恩諾沙星(ENR)、洛美沙星(LOM)、四環(huán)素(TE)、氨芐西林(APM)、復(fù)方新諾明(SXT)等16種抗生素藥敏紙片進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。結(jié)果得知，20株大腸桿菌對(duì)抗生素均有不同程度的耐藥，最高的為13耐，最低的為5耐。其中豬源9號(hào)菌株耐13種抗生素，2號(hào)、4號(hào)、7號(hào)菌株分別為9耐和11耐；牛源12號(hào)、14號(hào)、15號(hào)、20號(hào)菌株均為11耐(表1)。

表1 抗生素對(duì)大腸桿菌藥敏試驗(yàn)分析Table 1 The test results of antibiotic drug susceptibility to Escherichia coli

2.2 竹葉提取物藥敏試驗(yàn)

選擇對(duì)9種以上抗生素產(chǎn)生耐藥性的菌株(2、4、7、9、12、12、14、15、20號(hào)菌株)進(jìn)行竹葉提取物的藥敏試驗(yàn)。

由表2可知，竹葉提取物對(duì)抗生素耐藥的大腸桿菌有較明顯的抑制作用。結(jié)合表1可以看出，大腸桿菌對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥，對(duì)竹葉提取物依然敏感。不同季節(jié)采集的竹葉提取物對(duì)不同源不同株的大腸桿菌抑菌效果不同，對(duì)同源不同株的大腸桿菌抑菌效果也不同。冬季采集的竹葉提取物抑菌效果最佳，對(duì)受試菌株均在高敏以上，其中7、15和9號(hào)菌株對(duì)CTX 等16種抗生素表現(xiàn)11耐和13耐，對(duì)冬季竹葉提取液極敏；秋季抑菌效果相對(duì)較差，抑菌圈在低敏和中敏之間。一年四季抑菌效果比較是冬季>春季>夏季>秋季。說明不同季節(jié)采集的樣品抑菌效果不同。

2.3 竹葉提取物最小抑菌濃度(MIC)

不同季節(jié)采集的竹葉提取物對(duì)8株大腸桿菌均有不同程度的抑制作用。其中春、夏季采集的竹葉提取物對(duì)豬源、牛源大腸桿菌的MIC均在3.125～6.250 mg·mL-1之間，秋季MIC在6.25～12.50 mg·mL-1之間，冬季的MIC在1.560～3.125 mg·mL-1之間。說明冬季竹葉提取物對(duì)大腸桿菌的抑制作用較好，秋季較差(表3)。

表2 不同季節(jié)竹葉提取物對(duì)大腸桿菌的藥敏試驗(yàn)分析Table 2 The test results of the susceptibility of bamboo leaf extract in different seasons to Escherichia coli mm

表3 不同季節(jié)竹葉提取物對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度(MIC)Table 3 The minimum inhibitory concentration of bamboo leaf extract in different seasons to Escherichia coli mg·mL-1

2.4 竹葉提取物最小殺菌濃度(MBC)

由表5可知，不同季節(jié)采集的竹葉提取物對(duì)不同株的細(xì)菌均有不同程度的殺滅作用。春、夏季竹葉提取物對(duì)大腸桿菌的MBC均6.25～12.50 mg·mL-1之間，秋季MBC在12.5～25 mg·mL-1之間，冬季的在3.125～6.250 mg·mL-1之間。最小殺菌濃度均高于最小抑菌濃度的1個(gè)濃度梯度。說明不同季節(jié)采集的竹葉提取物抑菌效果較為穩(wěn)定。

表4 不同季節(jié)竹葉提取物對(duì)大腸桿菌的最小殺菌濃度(MBC)Table 4 The minimum bactericidal concentration of bamboo leaf extract in different seasons to Escherichia coli mg·mL-1

3 結(jié)論與討論

1) 本試驗(yàn)通過常規(guī)的細(xì)菌分離培養(yǎng)方法，從病豬心、肝等組織和患乳房炎奶牛的乳汁中分離得到大腸桿菌，通過抗生素藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)20株大腸桿菌對(duì)16種抗生素均有不同程度的耐藥，最高的13耐，最低的5耐。采用中藥傳統(tǒng)的煎煮方法提取竹葉中的有效成分，然后應(yīng)用竹葉提取物對(duì)抗生素耐藥的大腸桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果說明，大腸桿菌對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥，對(duì)竹葉提取物依然敏感。試驗(yàn)同時(shí)證明，竹葉提取物藥敏試驗(yàn)、最小抑菌濃度與最小殺菌濃度反應(yīng)的結(jié)果是一致的，不同源的大腸桿菌菌株對(duì)不同季節(jié)采集的竹葉提取液有著不同程度的敏感性。

2) 據(jù)報(bào)道[10-12]竹葉中含有黃酮類化合物和生物活性成分,隨竹種、季節(jié)的變化而變化。本次試驗(yàn)在研究竹葉抑菌效果的基礎(chǔ)上比較不同季節(jié)其提取物抑菌效果的差異.由表2、表3、表4可知，不同季節(jié)采集的竹葉提取物對(duì)不同源的大腸桿菌抑菌效果不同，春季抑菌圈在15～17 mm之間，MIC在3.125～6.250 mg·mL-1之間，MBC在6.25～12.50 mg·mL-1之間；夏季抑菌圈在13～15 mm之間；MIC在3.125～6.250 mg·mL-1之間，MBC在6.25～12.50 mg·mL-1之間；秋季抑菌圈在9～12 mm之間；MIC在6.25～12.50 mg·mL-1之間，MBC在12.5～25.0 mg·mL-1；冬季抑菌圈在15～20 mm之間，MIC在1.560～3.125 mg·mL-1之間，MBC在3.125～6.250 mg·mL-1。本試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了抑菌作用強(qiáng)弱與竹葉中含黃酮類化合物和生物活性成分隨竹種、季節(jié)的變化有關(guān)。本試驗(yàn)采用的竹種是孝順竹，采用定點(diǎn)、定株、定時(shí)采樣，不同季節(jié)抑菌效果強(qiáng)弱，順序?yàn)槎?春季>夏季>秋季。其他種類竹葉抑菌效果、季節(jié)的變化的強(qiáng)弱有待于進(jìn)一步研究。

3) 竹子的化學(xué)組成中不含有毒物質(zhì)，符合食品對(duì)原料和添加劑化學(xué)成分的嚴(yán)格要求，2002年國(guó)家衛(wèi)生部已將 “淡竹葉”列入既是食品又是藥品的保健食品原料名單[13]。因此開發(fā)竹葉作為畜禽飼料添加劑，既可以防治大腸桿菌病，又不會(huì)引起畜禽中毒，更重要的是減少細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，減少畜禽體內(nèi)抗生素的殘留，為人類提供綠色畜產(chǎn)品，保障人類身體健康。畜禽養(yǎng)殖戶也可以利用當(dāng)?shù)氐馁Y源在適當(dāng)時(shí)機(jī)采集竹葉煎煮后讓其動(dòng)物自由飲用，預(yù)防大腸桿菌病的發(fā)生。

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