潘小良 宋朝暉 梁巧米 王 敏

1.杭州市第一人民醫(yī)院輸血科，浙江杭州310006；2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院婦科，山東濟(jì)南250031

凝聚胺法與微柱凝集法檢測(cè)孕婦IgG血型抗體效價(jià)應(yīng)用比較

潘小良1宋朝暉1梁巧米1王 敏2

1.杭州市第一人民醫(yī)院輸血科，浙江杭州310006；2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院婦科，山東濟(jì)南250031

目的比較凝聚胺法與微柱凝集法檢測(cè)孕婦IgG血型抗體效價(jià)的效果。方法選擇2012年1月～2013年1月杭州市第一人民醫(yī)院就診的ABO血型不合的O型孕婦380例為研究對(duì)象，分別采用凝聚胺法與微柱凝集法檢測(cè)IgG抗A（B）效價(jià)，比較兩種檢測(cè)方法的效率；分析ABO血型不合孕婦IgG抗A（B）效價(jià)與妊娠次數(shù)及年齡的關(guān)系。結(jié)果①在380例ABO血型不合孕婦中，＞1次妊娠孕婦檢出IgG抗A（B）效價(jià)≥1∶64者所占比例[77.5%（110/142）]多于1次妊娠者[39.5%（94/238）]，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；年齡31～40歲孕婦IgG抗A（B）效價(jià)≥1∶64者[61.4%（156/254）]多于21～30歲孕婦[38.1%（48/126）]，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。②380例血型不合孕婦中，微柱凝集法檢測(cè)IgG抗A（B）效價(jià)≥1∶64者共352例，IgG抗A（B）效價(jià)＜1∶64者28例，凝聚胺法檢測(cè)IgG抗A（B）效價(jià)≥1∶64者共302例，＜1∶64者78例，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論微柱凝集法有操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、敏感性高、易標(biāo)準(zhǔn)化等諸多優(yōu)點(diǎn)，更具臨床應(yīng)用價(jià)值。

新生兒溶血??；凝聚胺法；微柱凝集法；IgG抗A（B）效價(jià)

新生兒溶血?。╤aemolytic disease ofthe newborn， HDN）特指母嬰血型不合引起胎兒或者新生兒的免疫性溶血性疾病，其中尤以ABO血型系統(tǒng)不合的最為常見(jiàn)，主要由IgG抗-A及抗-B抗體引起，多發(fā)生于O型母親所生的非O型新生兒[1]。孕婦IgG抗A（B）效價(jià)測(cè)定是HDN產(chǎn)前診斷有效手段，在HDN診治中發(fā)揮著重要作用。為了探尋更具臨床價(jià)值的檢測(cè)方法，筆者對(duì)較新的微柱凝集法與常用的凝聚胺法進(jìn)行了比較分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2012年1月～2013年1月杭州市第一人民醫(yī)院就診的夫婦血型不合的O型孕婦380例為研究對(duì)象，丈夫?yàn)锳型者測(cè)IgG抗-A，丈夫B型的測(cè)IgG抗-B，丈夫AB型的同時(shí)測(cè)IgG抗-A和抗-B。孕齡24～40周；孕婦年齡21～40歲。采用凝聚胺法再次測(cè)定抗體效價(jià)，為避免RH系統(tǒng)的干擾，所選孕婦均為RHD陽(yáng)性，且不規(guī)則抗體篩檢陰性。

其中按照ABO血型檢測(cè)系統(tǒng)，入選孕婦中首次妊娠者共計(jì)238例，既往有妊娠史包括流產(chǎn)史者共142例；按照孕婦年齡分為21～30歲組（126例）和＞30～40歲組（254例）。

1.2 儀器

BASO血庫(kù)專(zhuān)用離心機(jī)；DiaMed（達(dá)亞美）凝膠卡專(zhuān)用孵育器和離心機(jī)。

1.3 試劑

0.01 mol/L二硫蘇糖醇（DTT）：取0.77 g DTT溶于500 mL生理鹽水；DiaMed公司的2號(hào)稀釋液和Liss/Coombs凝膠卡；0.8%及5%的A型和B型紅細(xì)胞懸液用獻(xiàn)血員血液自制；上海血液生物醫(yī)藥公司的抗A抗B定型試劑、IgM抗D試劑、篩選細(xì)胞；珠海BASO公司凝聚胺試劑盒。

1.4 方法

1.4.1 微柱凝集法孕婦血清200μL+0.01 mol/L的DTT溶液200μL，混勻后置37℃孵育30 min，以破壞IgM類(lèi)抗體。另取潔凈試管8支，編號(hào)1～8，第1管加達(dá)亞美2號(hào)稀釋液300μL，其余7管各加稀釋液200μL。取孵育后血清100μL加于第1管，混勻，取出200μL加入第2管，依次倍比稀釋?zhuān)?管取出200μL棄去。這樣1～8管的稀釋度分別是1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1024。取出達(dá)亞美Liss/Coombs卡，做好標(biāo)記，各孔加入0.8%的A型（或B型）紅細(xì)胞懸液50μL，再分別加1～8號(hào)管中不同稀釋比的液體25μL。將加好樣的凝膠卡置于專(zhuān)用孵育器內(nèi)，37℃孵育15 min。將孵育好的凝膠卡置于專(zhuān)用離心機(jī)，1000 r/min離心10 min。判讀結(jié)果：1～8管的IgG抗-A（抗-B）效價(jià)分別為8、16、32、64、128、256、512和1024。

1.4.2 凝聚胺法取潔凈小試管10支，編號(hào)1～10，第1管加0.01 mol/L的DTT溶液100μL及孕婦血清100μL，混勻后37℃孵育30 min。其余9管各加等滲鹽水100μL。從孵育后第1管吸取100μL加入第2管混勻，吸取100μL加入第3管，依次做倍比稀釋?zhuān)?0管取100μL棄去。各管分別加5%A型（或B型）紅細(xì)胞懸液1滴，混勻，各加低離子液（LIM）0.65 mL，混勻，各加凝聚胺（Polybrene）溶液2滴，混勻后3400 r/min離心10 s。倒去上清液，但不能瀝干，管底約需殘留0.1 mL液體。輕輕搖動(dòng)，觀察紅細(xì)胞是否凝集，若不凝集則實(shí)驗(yàn)失敗。最后滴加懸浮液（resuspending）2滴，輕搖試管，觀察凝集是否散開(kāi)，肉眼為不凝者需鏡檢核實(shí)。以最高稀釋度凝集管確定抗體效價(jià)，1～10管分別是2、4、8、16、32、64、128、256、512、1024。

1.4.3 血型鑒定ABO血型鑒定、RHD血型及不規(guī)則抗體篩檢根據(jù)操作規(guī)程[2]。

2 結(jié)果

2.1 孕婦血清IgG-A或IgG-B抗體效價(jià)測(cè)定

在380例ABO血型不合孕婦中，＞1次妊娠孕婦檢出IgG抗A（B）效價(jià)≥1∶64者比例[77.5%（110/ 142）]多于1次妊娠者[39.5%（94/238）]，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；年齡＞30～40歲孕婦IgG抗A（B）效價(jià)≥1：64者[61.4%（156/254）]多于21～30歲孕婦[38.1%（48/126）]，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.24，P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 ABO血型不合孕婦IgG-A或IgG-B抗體效價(jià)與妊娠次數(shù)及年齡的關(guān)系[n（%）]

2.2 兩種檢測(cè)方法在IgG抗A（B）效價(jià)中的效率比較

380例血型不合孕婦中，微柱凝集法檢測(cè)IgG抗A（B）效價(jià)≥1∶64者共352例，IgG抗A（B）效價(jià)＜1∶64者28例，凝聚胺法檢測(cè)IgG抗A（B）效價(jià)≥1∶64者共302例，＜1∶64者78例，兩者≥1∶64者所占比例比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.87，P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 兩種檢測(cè)方法在IgG抗A（B）效價(jià)中的效率比較[n（%）]

3 討論

HDN起源于胎兒從父親方繼承了母親方所沒(méi)有的紅細(xì)胞抗原，這些抗原可能受到來(lái)自母血的免疫抗體的攻擊，因?yàn)槟阁w的IgG類(lèi)抗體可以自由通過(guò)胎盤(pán)屏障，使胎兒紅細(xì)胞遭受破壞，出現(xiàn)黃疸、水腫、肝脾腫大、貧血，甚至死胎、新生兒死亡等溶血癥狀。在所有抗體中，只有IgG類(lèi)抗體能夠通過(guò)胎盤(pán)，因此只有IgG才可能引發(fā)HDN。造成ABO血型系統(tǒng)HDN的抗體主要是IgG抗-A和IgG抗-B，這些抗體常常無(wú)需經(jīng)過(guò)明顯的免疫刺激就可“天然”存在于一些O型人體內(nèi)，所以O(shè)型孕婦第一胎就可能發(fā)生HDN，這有別于Rh系統(tǒng)的HDN[3]。IgG抗-A（B）的濃度（效價(jià)）是影響ABO HDN嚴(yán)重程度的重要因素，一般認(rèn)為抗體效價(jià)≥64才可能造成HDN，所以，當(dāng)母體抗體效價(jià)≥64時(shí)，發(fā)生HDN的可能性就較高了。當(dāng)然，HDN的嚴(yán)重程度還受新生兒ABO抗原的強(qiáng)弱、不同IgG亞類(lèi)和胎盤(pán)功能等因素影響[4]。

凝聚胺（polymatching）法首先利用低離子介質(zhì)降低溶液的離子強(qiáng)度，減少紅細(xì)胞周?chē)年?yáng)離子云，促進(jìn)血清中的抗體與紅細(xì)胞相應(yīng)抗原結(jié)合，再加入帶正電荷的高價(jià)陽(yáng)離子多聚物一凝聚胺，中和紅細(xì)胞表面存在的大量負(fù)電荷，縮短細(xì)胞間距，形成可逆的非特異性聚集，并使IgG型抗體能直接凝集紅細(xì)胞。加入中和液后，僅由凝聚胺引起的非特異性聚集，會(huì)因電荷中和而分散，而由抗體介導(dǎo)的特異性凝集則不會(huì)散開(kāi)[5]。本試驗(yàn)是紅細(xì)胞膜抗原與抗體在凝膠介質(zhì)中發(fā)生的凝集反應(yīng)，通過(guò)具有分子篩作用的凝膠顆粒構(gòu)成的膠體介質(zhì)，使游離紅細(xì)胞和聚集紅細(xì)胞得以分離。手工凝聚胺可用于不完全抗體的測(cè)定與鑒定及交叉配血。本法的特點(diǎn)是：靈敏度比抗球蛋白法高1～20倍，速度快，準(zhǔn)確度高于酶試驗(yàn)[6]。微柱凝集作為一項(xiàng)免疫學(xué)檢測(cè)新技術(shù)，是凝膠過(guò)濾技術(shù)和抗原抗體反應(yīng)的結(jié)合，在歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家已作為常規(guī)性檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于臨床[7]，由于凝膠顆粒具有分子篩作用，抗原抗體反應(yīng)后的紅細(xì)胞通過(guò)離心經(jīng)過(guò)微柱，無(wú)IgG結(jié)合的紅細(xì)胞穿過(guò)凝膠到達(dá)底部，而紅細(xì)胞上若有IgG抗體結(jié)合則會(huì)被凝膠中的抗IgG拉住，紅細(xì)胞被阻止在凝膠柱上層或中間。本法有操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、敏感性高、標(biāo)本量少、易標(biāo)準(zhǔn)化等諸多優(yōu)點(diǎn)[6]。具體表現(xiàn)為：①簡(jiǎn)便。操作如同試管法及玻片法一樣簡(jiǎn)單、方便，樣本不需要經(jīng)過(guò)洗滌，對(duì)陰性結(jié)果不需要確證實(shí)驗(yàn)，適用于大量標(biāo)本檢測(cè)，解決了抗球蛋白試驗(yàn)因程序復(fù)雜耗時(shí)較長(zhǎng)而未能在臨床常規(guī)應(yīng)用的問(wèn)題。多份檢測(cè)標(biāo)本一次離心即出結(jié)果，有利于臨床大量標(biāo)本應(yīng)用，單份標(biāo)本多項(xiàng)指標(biāo)一次離心出結(jié)果，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)程序。②準(zhǔn)確。結(jié)果清晰明確，可重復(fù)性強(qiáng)，將凝集結(jié)果從傳統(tǒng)的顯微鏡下平面識(shí)別模式轉(zhuǎn)換至卡式立體肉眼判斷，避免因經(jīng)驗(yàn)不足對(duì)結(jié)果判斷的影響。③敏感。微柱凝集法對(duì)臨床不完全抗體的檢測(cè)敏感性恰到好處，假陽(yáng)性和假陰性率均低。④結(jié)果保存時(shí)間長(zhǎng)。室溫條件下，試驗(yàn)結(jié)果即標(biāo)本原始反應(yīng)格局一般可保存數(shù)日至數(shù)周。其結(jié)果還可以拍照存檔，數(shù)據(jù)可以永久保存，并可以遠(yuǎn)程傳輸，甚至允許遠(yuǎn)程多方會(huì)診。⑤標(biāo)本用量少。其標(biāo)本量?jī)H為傳統(tǒng)試管法的1/10～1/5，尤其有利于新生兒及某些特殊血液病標(biāo)本的檢測(cè)。⑥標(biāo)準(zhǔn)化。微柱凝集卡、檢測(cè)試劑、專(zhuān)用離心機(jī)、判讀儀及工作程序和結(jié)果判定均易于規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化。⑦安全。整個(gè)操作過(guò)程能夠最大限度減少接觸血液標(biāo)本及病原微生物的機(jī)會(huì)，減少醫(yī)源性感染。但是，微柱凝集技術(shù)也有其局限性，由于需嚴(yán)格按照試劑盒操作規(guī)程操作，使得工作人員的依賴(lài)性增大，不利于專(zhuān)業(yè)技術(shù)的積累和提高。微柱凝集檢測(cè)系統(tǒng)是商業(yè)化產(chǎn)品，因此其成本較傳統(tǒng)的血清學(xué)試驗(yàn)（如凝聚胺技術(shù)）高出許多。微柱凝集抗人蛋白試驗(yàn)及微柱凝膠免疫檢測(cè)技術(shù)的本質(zhì)是血凝試驗(yàn)，這在理論上為制備抗原抗體包被的紅細(xì)胞為指示紅細(xì)胞，以間接血凝試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)紅細(xì)胞抗原抗體以外的其他血液細(xì)胞、腫瘤標(biāo)志物、病原微生物，以及機(jī)體其他可溶性抗原抗體，如對(duì)藥物抗體、自身抗體等的檢測(cè)都提供了比傳統(tǒng)血凝試驗(yàn)更加敏感、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的方法。所以說(shuō)微柱凝集技術(shù)必將在臨床醫(yī)學(xué)各個(gè)領(lǐng)域有更為廣闊的發(fā)展。

盡管凝聚胺法與微柱凝集法都是檢測(cè)不完全抗體的敏感方法，但本次比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在應(yīng)用于IgG抗體效價(jià)方面，微柱凝集法的敏感度遠(yuǎn)高于凝聚胺法，絕大多數(shù)標(biāo)本的結(jié)果相差1～2個(gè)量級(jí)，差異程度遠(yuǎn)高于其他研究結(jié)果[8-11]。本研究結(jié)果中，妊娠次數(shù)＞1次的孕婦其產(chǎn)生IgG抗A（B）效價(jià)≥1∶64的比例高于僅有1次妊娠者，且＞30～40歲間的孕產(chǎn)婦其出現(xiàn)IgG抗A（B）效價(jià)≥1∶64者比例高于21～30歲者，說(shuō)明高齡及有多次妊娠的產(chǎn)婦其出現(xiàn)ABO-HDN的概率較高，臨床上應(yīng)尤其對(duì)符合上述特點(diǎn)的孕婦定期進(jìn)行IgG抗A（B）效價(jià)檢查，對(duì)IgG抗A（B）效價(jià)≥1∶64者及時(shí)采取相應(yīng)預(yù)防及治療手段。未發(fā)現(xiàn)兩種方法的結(jié)果差異性在檢測(cè)不同抗體（抗-A與抗-B）中有所不同?？焖贉?zhǔn)確測(cè)定IgG抗體效價(jià)，能在預(yù)測(cè)ABO HDN的發(fā)生及疾病程度上為臨床提供有效的信息。臨床上通常以效價(jià)64作為有可能發(fā)生HDN的臨界指標(biāo)，更為敏感的微柱凝集法能夠更早發(fā)現(xiàn)孕婦IgG抗體的異常，可盡早醫(yī)學(xué)干預(yù)，因而也具有更大的臨床價(jià)值。鑒于傳統(tǒng)的凝聚胺法與微柱凝集法靈敏度的較大差異，測(cè)定的結(jié)果不具直接可比性，建議實(shí)驗(yàn)室建立兩種方法各自不同的參考值。

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Comparison of the application of polybrene method and micro-column agglutination assay in the detecting of IgG blood antibody of pregnant women

PAN Xiaoliang1SONG Chaohui1LIANG Qiaomi1WANG Min2
1.Department of Blood Transfusion,the First People's Hospital of Hangzhou City,Zhejiang Province,Hangzhou 310006,China;2.Department of Gynaecology,Affiliated Hospital of Shandong Academy of Medical Sciences,Shandong Province,Ji′nan 250031,China

ObjectiveTo compare the effect of polybrene method and micro-column agglutination assay in detecting of pregnant women maternal IgG blood antibody.Methods380 O blood type pregnant women with ABO blood type incompatibility in the First People's Hospital of Hangzhou City from January 2012 to January 2013 were selected as study objects.Polybrene method and micro-column agglutination assay were used to detect the titer of IgG blood antibody, the efficiency of the two methods was compared.The relationship of IgG-A and IgG-B blood antibody titer and number of pregnancies,age in O blood type pregnant woman of ABO blood type incompatibility was analyzed.Results①The percentage of IgG-A,IgG-B blood antibody titer≥1∶64 in pregnant woman with＞1 time of pregnancy[77.5%(110/142)] was more than that in pregnant woman with 1 time of pregnancy[39.5%(94/238)],the differences were statistically significant(P＜0.05).The percentage of IgG-A,IgG-B blood antibody titer≥1∶64 in pregnant woman of 31-40 years old[61.4%(156/254)]was more than that in pregnant woman of 21-30 years old[38.1%(48/126)],the differences were statistically significant(P＜0.05).②352 cases of IgG blood antibody titer≥1∶64 and 28 cases of IgG blood antibody titer＜1∶64 were found by the method of polybrene,302 cases of IgG blood antibody titer≥1∶64 and 78 cases of IgG blood antibody titer＜1∶64 were found by the method of micro-column agglutination,the differences were statistically significant(P＜0.05).ConclusionMicro-column agglutination method has the advantage of easy operation,consequence accuracy,high sensibility,and has more clinical application value.

Haemolytic disease of the newborn;Polybrene;Micro-column agglutination;IgG-A and IgG-B blood antibody titer

R446

A

1673-7210（2014）03（b）-0085-04

2013-11-12本文編輯：任念）

山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)2011AS10363）。

潘小良（1967.4-），男，副主任技師；研究方向：醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、臨床輸血、新生兒溶血。