蔡曄 饒品彬 吳海港 姜永厚

（浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，杭州 310018）

EvaGreen實(shí)時熒光定量PCR檢測豬圓環(huán)病毒2型方法的建立

蔡曄 饒品彬 吳海港 姜永厚

（浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，杭州 310018）

根據(jù)GenBank中的豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）ORF4基因序列設(shè)計一對特異性引物，通過常規(guī)PCR擴(kuò)增PCV2的ORF4基因，并將其純化的PCR產(chǎn)物克隆入pMD18-T載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒。應(yīng)用該重組質(zhì)粒進(jìn)行EvaGreen實(shí)時熒光定量PCR，建立了PCV2 DNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行熔解曲線分析。結(jié)果顯示：建立的EvaGreen實(shí)時熒光定量PCR特異性強(qiáng)，與其他非靶標(biāo)病毒基因不發(fā)生交叉反應(yīng)；靈敏度高，最高可檢測到10拷貝/μL的病毒量；重復(fù)性好，3個濃度的批間和批內(nèi)的變異系數(shù)均小于2.5%；對118份臨床樣品進(jìn)行檢測，陽性樣品25份，陽性率為21.2%，檢測結(jié)果與普通PCR相符率為99.2%，其中一份樣品經(jīng)熒光PCR檢測為PCV2陽性，普通PCR檢測為陰性。結(jié)果表明，建立的EvaGreen實(shí)時熒光定量PCR方法具有特異性強(qiáng)、敏感度高、重復(fù)性好、簡便快捷等特點(diǎn)，可用于臨床PCV2感染的早期診斷以及分子流行病學(xué)調(diào)查。

豬圓環(huán)病毒2型 EvaGreen 實(shí)時熒光定量PCR 檢測

豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種重要的豬病病原，與在各地廣泛流行的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）、豬呼吸道疾病綜合征（Porcine respiratory disease complex，PRDC）、豬皮炎與腎病綜合征（Porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS）、仔豬先天性震顫（Congenital tremor，CT）及豬繁殖系統(tǒng)障礙等多種疾病密切相關(guān)［1，2］，其中以PMWS危害最大，給世界各地養(yǎng)豬業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失。PCV2具有自身特

有的生物學(xué)特性，單一感染PCV2后一般不會引起明顯的發(fā)病，但由于其具有持續(xù)性感染和免疫抑制作用，能誘發(fā)病豬產(chǎn)生免疫抑制后繼發(fā)感染和混合感染其他病原，且其致病性與病毒載量相關(guān)，導(dǎo)致其潛在危害很大［3-5］。因此建立一種快速準(zhǔn)確的診斷方法對PCV2進(jìn)行早期快速檢測，對促進(jìn)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。

實(shí)時熒光定量PCR（Real-time fluorescent quantitative PCR，Real-time PCR）是在普通PCR技術(shù)基礎(chǔ)上加入熒光基團(tuán)發(fā)展起來的一種快速靈敏的核酸檢測技術(shù)，彌補(bǔ)了常規(guī)的病毒分離鑒定、血清學(xué)等方法對感染早期無法確診及普通PCR技術(shù)不能精確定量和假陽性率高等缺點(diǎn)［6，7］，可應(yīng)用于病毒疾病的早期診斷。實(shí)時熒光定量PCR一般包括熒光雜交探針和熒光染料兩類，與熒光探針實(shí)時定量PCR方法比較，染料法實(shí)時定量PCR避免了設(shè)計、標(biāo)記熒光探針，檢測費(fèi)用相對降低，同時適用于任何PCR擴(kuò)增體系［8］。EvaGreen是一種新型的用于實(shí)時熒光定量PCR的DNA結(jié)合熒光染料，對PCR的抑制性遠(yuǎn)小于在實(shí)時熒光定量PCR中使用較多的SYBR Green染料［9］。因此，EvaGreen在Real-time PCR中可使用較高工作濃度，從而獲得比SYBR Green更好的擴(kuò)增信號，其穩(wěn)定性也強(qiáng)于SYBR Green［10，11］。基于此本研究擬建立一種EvaGreen實(shí)時熒光定量PCR方法用于PCV2的檢測，應(yīng)用于PCV2的早期診斷中，同時也為進(jìn)一步開展疫苗研究、診斷試劑研發(fā)等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株與臨床樣品 PCV2參考株由本實(shí)驗室保存，陰性對照包括豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）和豬乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）疫苗干粉購自武漢科前動物生物制品有限公司；豬細(xì)小病毒（Porcine parvovirus，PPV）疫苗干粉購自北京中海保健科技有限公司；豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、豬流感病毒（Swine influenza virus，SIV）、豬圓環(huán)病毒1型（Porcine circovirus type 1，PCV1）及其他相關(guān)菌株均由本實(shí)驗室保存。118份臨床樣品（58份血清樣品和60份組織樣品），其中血清樣品收集自湖北、福建、安徽、廣東、河南、浙江及天津等地豬場；組織樣品包括豬肺、淋巴結(jié)、肝及腎等收集自杭州市下沙附近的5個豬肉市場。

1.1.2 主要試劑與儀器TaqDNA聚合酶、dNTPs、蛋白酶K等購自上海生工生物工程有限公司；pMD18-T vector、Agarose、DNA Marker DL2000、MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.3.0等購自TaKaRa公司；EB固體購自Boehringer Mannheim公司；EvaGreen購自Biotum公司。DNA Gel Extraction Kit及Plasmid Mini Kit購自Axygen公司。PCR擴(kuò)增儀Bio-Rad S1000；凝膠成像分析系統(tǒng)Tanon 1600；紫外分光光度計Nanodrop 2000；離心機(jī) Fresco 21；熒光定量PCR儀ABI 7300。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的PCV2（GQ996404）ORF4基因核苷酸序列用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計一對引物1，其相應(yīng)PCR產(chǎn)物（371 bp）用于構(gòu)建重組質(zhì)粒，并在此擴(kuò)增產(chǎn)物序列范圍內(nèi)（299-669 bp）再設(shè)計一對用于EvaGreen實(shí)時熒光定量PCR的引物2，其對應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物長度為71 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

引物1上游（F1）：5'-CGAGAAAGCGAAAGGAACMGA-3'，下游（R1）：5'-GGTAACCATCCCACCACTT-3'；引物2上游（F2）：5'-CGAGAAAGCGAAAGGAA-3'，下游（R2）：5'-ACTCGATCAGTAAGTTGCC-3'。

1.2.2 PCV2重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備

1.2.2.1 PCV2核酸提取及普通PCR擴(kuò)增 參照病毒RNA/DNA小量制備試劑盒說明書，從感染PCV2的細(xì)胞株中提取PCV2的病毒DNA。以提取的總DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，依次加入10×Buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl22 μL，0.5 μL的上下游引物1，2.5 mmol/L dNTPs 0.5 μL，TaqDNA（5 U/μL）0.3 μL，1 μL的模板DNA（約100 ng），加入ddH2O至總體積為25 μL。反應(yīng)程序：95℃ 3 min；94℃ 30 s，56℃30 s，72℃ 30 s，30個循環(huán)；72℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，使用DL2000 Marker對目的片段進(jìn)行1%的瓊脂糖凝

膠電泳檢測。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品模板構(gòu)建 用引物1進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)擴(kuò)增PCV2完成后，PCR產(chǎn)物回收純化后克隆到pMD18-T載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入DH 5α感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，通過Amp+培養(yǎng)基篩選，提取重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR鑒定，并將電泳檢測正確的重組質(zhì)粒委托上海生工生物工程公司進(jìn)行序列測定，將經(jīng)測序驗證后，序列正確的重組質(zhì)粒用紫外分光光度計Nanodrop 2000測定OD260，根據(jù)阿弗加德羅常數(shù)將濃度轉(zhuǎn)換為拷貝數(shù)，再按10倍梯度進(jìn)行系列稀釋，制備成1.0×100-1.0×107拷貝/μL的PCV2重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.3 PCV2 EvaGreen實(shí)時熒光定量PCR方法建立

反應(yīng)總體積為10 μL，反應(yīng)體系組成為：25 mmol/L Mg2+1.2 μL，10×Buffer 1 μL，2.5 mmol/L dNTPs 0.8 μL，20×EvaGreen 0.5 μL，0.5 UTaq酶，上下游引物2各0.2 μL，質(zhì)粒模板1 μL，補(bǔ)充ddH2O至10 μL。反應(yīng)擴(kuò)增程序為：95℃ 3 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)；擴(kuò)增完成后，制作熔解曲線。熔解曲線程序為：95℃ 15 s，60℃1 min，95℃ 15 s，60℃開始收集熒光信號制作熔解曲線。

1.2.4 PCV2 EvaGreen實(shí)時熒光定量PCR方法評價1.24.1 特異性 按照EvaGreen實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)體系配制9份，l份加入PCV2的DNA 1 μL（約100 ng），其余8份作為對照組，模板分別加入其他7種豬病毒包括PRV、JEV、PPV、CSFV、PRRSV、SIV和PCV1的DNA/cDNA 1 μL（約100 ng），還有1份加入ddH2O 1 μL為陰性對照，按實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)程序擴(kuò)增，驗證其特異性。

1.2.4.2 靈敏度 將PCV2標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度系列濃度稀釋，進(jìn)行EvaGreen實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)。通過能夠檢測出陽性結(jié)果的最高稀釋度的拷貝數(shù)，確定PCV2在EvaGreen實(shí)時熒光定量PCR中靈敏度。

1.2.4.3 重復(fù)性 選取PCV2的3個濃度梯度（104、103、102拷貝/μL）的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行批內(nèi)、批間重復(fù)試驗。批內(nèi)重復(fù)試驗是將每個濃度在同一次EvaGreen實(shí)時熒光定量PCR中重復(fù)3次；批間重復(fù)試驗是在3次不同時間段進(jìn)行試驗對3個梯度進(jìn)行EvaGreen實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)。

1.2.5 臨床樣品檢測 對118份臨床樣品分別進(jìn)行EvaGreen實(shí)時熒光定量PCR和常規(guī)PCR檢測，比較其檢測結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 PCV2 ORF4基因的PCR擴(kuò)增、克隆及鑒定

取PCR產(chǎn)物5 μL于1%瓊脂糖上電泳，結(jié)果表明擴(kuò)增產(chǎn)物為371 bp左右的DNA片段（圖1）與預(yù)期的片段長度相一致。經(jīng)鑒定，該片段與連接前的PCR產(chǎn)物片段長度一致。測序結(jié)果顯示，所獲序列與GenBank上PCV2的ORF4基因序列完全一致，表明重組質(zhì)粒中含有該基因核苷酸序列。

圖1 PCV2 ORF4基因的PCR擴(kuò)增

2.2 PCV2 EvaGreen實(shí)時熒光定量PCR檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

通過多次重復(fù)試驗，按優(yōu)化的反應(yīng)條件，以PCV2重組質(zhì)粒稀釋成系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品（106、105、104、103、102和50拷貝/μL）進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)，得到PCV2熒光定量PCR擴(kuò)增動力學(xué)曲線（圖2）。

根據(jù)PCV2熒光定量PCR擴(kuò)增動力學(xué)曲線，以lg濃度值（lgCo）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)Ct值為縱坐標(biāo)，在ABI7300上生成相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3），其中斜率為-3.37，截距為37.66，擴(kuò)增效率為0.980（相關(guān)系數(shù)為大于0.99），從而可以得出拷貝數(shù)與Ct值之間的線性關(guān)系曲線表達(dá)式 Ct= -3.37×lgCo+37.66，而待測樣品的Ct值可以從儀器讀取，把待測樣品的Ct值代入表達(dá)式就可以算出其初始拷貝數(shù)。

2.3 實(shí)時熒光定量PCR檢測方法的特異性

將PCV2、PPV、PRRSV、JEV、CSFV、PCV1、SIV和PRV及陰性對照（ddH2O）在優(yōu)化好的實(shí)時

熒光定量PCR條件下進(jìn)行熒光定量PCR檢測，結(jié)果（圖4）發(fā)現(xiàn)除PCV2能夠顯示正常擴(kuò)增曲線外，其他病毒和陰性對照（NTC）均不能檢測到正常擴(kuò)增曲線（熒光信號未達(dá)到閾值），表明所建立的方法具有較強(qiáng)的特異性。

圖2 PCV2 EvaGreen實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增曲線

圖3 PCV2 EvaGreen實(shí)時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 PCV2 EvaGreen實(shí)時熒光定量PCR特異性

2.4 實(shí)時熒光定量PCR檢測方法的靈敏度

將PCV2重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10倍梯度稀釋進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR，經(jīng)實(shí)時擴(kuò)增完成后，通過熔解曲線分析，所能產(chǎn)生熔解峰的最低拷貝數(shù)即為PCV2的檢測極限，其在106、105、104、103、102、50、25及10 拷貝/μL時均有明顯熔解峰，在100拷貝/μL時沒有熔解峰，即EvaGreen實(shí)時熒光定量PCR檢測PCV2的靈敏度可達(dá)10拷貝/μL（圖5）。

圖5 PCV2 EvaGreen實(shí)時熒光定量PCR靈敏度

2.5 實(shí)時熒光定量PCR檢測方法的重復(fù)性

為了驗證實(shí)時熒光定量PCR檢測結(jié)果的重復(fù)性，選取104、103及102拷貝/μL 3個濃度進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗。在批內(nèi)重復(fù)中變異系數(shù)（Coefficient of variation，CV）分別為0.81%、1.90%和1.49%，批間重復(fù)中CV分別為1.19%、2.32%和2.46%，兩種重復(fù)試驗的變異系數(shù)均小于2.5%（表 1），表明實(shí)時熒光定量PCR檢測方法具有較高的重復(fù)性，從而保證了不同樣品間檢測結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性。

2.6 臨床樣品檢測

對118份樣品進(jìn)行處理，利用病毒RNA/DNA抽提試劑盒從樣品中提取DNA。應(yīng)用本研究所建立的EvaGreen實(shí)時熒光定量PCR方法和常規(guī)PCR方法同時對樣品進(jìn)行PCV2檢測，其中用實(shí)時熒光定量PCR方法共檢測出25份PCV2陽性樣品（11份陽性血清樣品和14份陽性組織樣品），陽性率為21.2%，而經(jīng)普通PCR方法只檢測出24份PCV2陽

性樣品（11份陽性血清樣品和13份陽性組織樣品），陽性率為20.3%，實(shí)時熒光定量PCR檢測靈敏度明顯高于普通PCR，能檢測出普通PCR不能檢測出的感染病毒樣品。

表1 PCV2的EvaGreen實(shí)時熒光定量PCR重復(fù)性

3 討論

近年來，PCV2及其相關(guān)疾病在豬群中廣泛流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。由于PCV2感染主要通過引起機(jī)體免疫抑制，進(jìn)而導(dǎo)致繼發(fā)性感染和條件性感染而引起發(fā)?。?2，13］。因此，進(jìn)行病毒抗原或核酸的早期檢測尤為重要。實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)因其快速、特異、敏感等優(yōu)點(diǎn)而在病毒早期檢測中越來越被廣泛應(yīng)用［14，15］。

本研究通過構(gòu)建PCV2陽性重組質(zhì)粒，用EvaGreen染料法進(jìn)行Real-time PCR，得到Real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算出其直線回歸方程，通過線性回歸方程可以對PCV2陽性樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定量。從靈敏度試驗結(jié)果可見，最高可檢測稀釋到10拷貝/μL的病毒模板，通過對熔解曲線分析，產(chǎn)物的熔解峰（Tm value）值相同，并未出現(xiàn)明顯的非特異性熔解峰。在特異性試驗中除PCV2有擴(kuò)增曲線外，其他非靶標(biāo)病毒基因和陰性對照均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線（熒光信號未達(dá)到閾值），說明本方法特異性強(qiáng)，而且批內(nèi)和批間重復(fù)試驗的變異系數(shù)均小于2.5%，也同時證明了本方法具有高度可重復(fù)性，從而保證檢測結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性。

在對118份臨床樣品的檢測中，本研究結(jié)果顯示25份PCV2陽性，而普通PCR檢測只有24份陽性。通過分析陽性樣品在擴(kuò)增曲線上的對應(yīng)的Ct值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上的位置，計算出所檢測陽性樣品病毒量大都集中在106-105拷貝/μL。實(shí)時熒光定量PCR檢測呈陽性而普通PCR檢測呈陰性的樣品，其拷貝數(shù)通過計算約為103拷貝/μL，比較103拷貝/μL的PCV2陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)普通PCR檢測后也為陰性，兩者檢測結(jié)果一致，再次驗證本研究中的方法，檢測敏感性明顯高于普通PCR，表明該方法能夠用于PCV2的早期診斷中。應(yīng)用該熒光PCR方法的檢測結(jié)果顯示，在血清樣品中PCV2檢出率為19.0%，與梁鵬帥等［16］利用套式PCR檢測多個豬場收集的807份血清樣品，不同豬場間PCV2陽性率為15.83%-43.33%檢測情況相符；在組織樣品檢測中PCV2檢出率為23.3%，與刁有祥等［17］應(yīng)用PCR方法對125份臨床健康豬肺臟進(jìn)行PCV2的檢測，其陽性率為16.8%，兩者比較一致，證實(shí)了本研究方法對樣品的檢測結(jié)果，符合PCV2的流行情況。由于其中的組織樣品取自豬肉市場，本研究方法檢測結(jié)果也表明PCV2存在很嚴(yán)重的亞臨床感染，是養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的一大潛在危險，應(yīng)當(dāng)引起足夠的重視。

本研究方法與普通PCR相比，擴(kuò)增和檢測都在同一管內(nèi)完成，不需PCR產(chǎn)物后處理，有效解決了污染問題，還能利用96孔板同時檢測96個樣品，能直接分析檢測結(jié)果，既方便又省時；與一般使用的SYBR Green Ⅰ實(shí)時熒光定量PCR相比，具有更好的特異性、穩(wěn)定性，能顯示更高的熒光信號強(qiáng)度。本方法檢測敏感性比SYBR Green Ⅰ實(shí)時熒光定量PCR檢測高10倍左右［18，19］；與探針法相比，更加簡便，只需在EvaGreen反應(yīng)混合液中加入引物和待測樣品即可，成本相對低廉，且無須合成價格昂貴的探針，同時檢測敏感性能達(dá)到探針檢測水平［20］。

4 結(jié)論

本研究建立的檢測豬圓環(huán)病毒2型EvaGreen實(shí)時熒光定量PCR方法是一種快速、準(zhǔn)確、簡便的檢測方法，同時為PCV2的定性或定量檢測、致病機(jī)理及其防控措施研究奠定了良好技術(shù)基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Development of EvaGreen Real-time Fluorescence Quantitative Polymerase Chain Reaction to Detect Porcine Circovirus Type 2

Cai Ye Rao Pinbin Wu Haigang Jiang Yonghou
（College of Life Science，Zhejiang Sci-Tech University，Hangzhou 310018）

According to genome sequences of ORF4 of porcine circovirus type 2（PCV2）published in GenBank, a pair of primers was designed. The ORF4 gene was amplified with traditional PCR. The PCR product was cloned into pMD18-T vector and sequenced to construct positive recombinant plasmid. The recombinant plasmid was used as template for EvaGreen real-time PCR to generate standard curve and melt curve. The results showed that EvaGreen real-time PCR in the present study was highly specific while used to detect other nontarget viruses, and its sensitivity was proved to be 10 copies/μL and reproducibility for both intra-assay and inter-assay were less than 2.5%. Then the established method was utilized to test 118 clinical samples. The result indicated that the PCV2 positive rate was 25/118, which was 99.2% consistent with that of conventional PCR tests, except one sample that was positive for PCV2 by real-time PCR but negative by conventional PCR. Thus, this method in the current study showed the characteristics of specificity, sensitivity, reproducibility and simple operation, which could be used in subclinical diagnosis and epidemiological investigation of PCV2.

Porcine circovirus type 2 EvaGreen Real-time PCR Detection

2014-01-18

浙江省科技攻關(guān)項目（2008C22081）

蔡曄，女，研究方向：動物病毒學(xué)；E-mail：meviky_cy@sina.cn；饒品彬同為本文第一作者

姜永厚，男，博士，副教授，研究方向：病毒分子診斷與動物病毒分子生物學(xué)；E-mail：yonghoujiang@163.com