程艷偉 靳夢(mèng)醒 閆 海 黃大可 黃保軍 張林杰

(安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，合肥 230032)

革蘭陰性菌感染機(jī)體后，巨噬細(xì)胞通過(guò)其表面膜受體，在其他輔助蛋白的共同作用下識(shí)別革蘭陰性菌細(xì)胞壁成分脂多糖(LPS)，引起一系列炎癥因子的釋放，誘發(fā)多種炎癥反應(yīng)，以限制清除病原菌。然而過(guò)度的炎癥反應(yīng)則會(huì)造成機(jī)體嚴(yán)重傷害［1，2］。

目前認(rèn)為重度炎癥發(fā)生時(shí)伴隨多種組織細(xì)胞的線粒體損傷及功能障礙。PRAK2 基因最早在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)產(chǎn)物parkin 是一種E3 泛素蛋白連接酶，在泛素蛋白酶體系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。parkin 能選擇性的聚集在損傷線粒體上，通過(guò)誘導(dǎo)線粒體自噬而清除損傷線粒體［3］。在多巴胺神經(jīng)元和HEK293 等細(xì)胞中，parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬對(duì)維持細(xì)胞的正常功能和細(xì)胞生存發(fā)揮重要作用［4］。但在巨噬細(xì)胞對(duì)LPS 刺激的應(yīng)激反應(yīng)中，parkin 及其介導(dǎo)的線粒體自噬是否參與對(duì)損傷線粒體的清除，目前尚不清楚。本研究擬通過(guò)建立小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)毒素應(yīng)激模型，觀察巨噬細(xì)胞在內(nèi)毒素刺激后parkin 表達(dá)分布及線粒體自噬發(fā)生情況，為進(jìn)一步完善炎癥反應(yīng)調(diào)控的可能途徑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 昆明種小鼠由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;LPS 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司;RPMI1640 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司;胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司;TRIzol 試劑和Mitotracker Green 染料購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司;mRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega 公司;PCR Mix 購(gòu)自美國(guó)MBI Fermentas公司;parkin 單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司;LC3 單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CST 公司;β-actin 單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗小鼠二抗購(gòu)自北京中杉金橋公司;Alexa Fluor 647 標(biāo)記山羊抗兔IgG (H+L)和Cy3 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H +L)購(gòu)自上海碧云天公司;特異性引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離和原代培養(yǎng) 取20～25 g 昆明小鼠，頸椎脫臼處死，無(wú)菌分離小鼠腹腔細(xì)胞。將混合細(xì)胞懸液放入培養(yǎng)箱中，靜置2 h，讓巨噬細(xì)胞貼壁。清除懸浮細(xì)胞后，得到腹腔巨噬細(xì)胞，然后再加入含10%胎牛血清、1%雙抗的1640完全培養(yǎng)基，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至少4 h 后，再給細(xì)胞以相應(yīng)處理。

1.2.2 JC-1 法檢測(cè)線粒體膜電位 將巨噬細(xì)胞接種于6 孔板中，每孔加入200 ng/ml LPS 分別作用0、3、6、12、18 h 和24 h，輕輕刮掉細(xì)胞，連同上清液一起1 500 r/min，離心10 min，獲得細(xì)胞。依據(jù)JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒說(shuō)明，按懸浮細(xì)胞方法處理，于流式細(xì)胞分析儀上檢測(cè)線粒體膜電位情況。

1.2.3 RT-PCR 檢測(cè)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞parkin mRNA 的表達(dá)水平 收集培養(yǎng)皿中200 ng/ml LPS 處理0、3、6、12、18 h 和24 h 后細(xì)胞，用TRIZOL 法提取各組巨噬細(xì)胞總RNA。先用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再將cDNA 用PCR Mix(2 ×)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。GAPDH 引物序列:上游引物5'-CAG TGG CAA AGT GGA GAT TGT TG-3'，下游引物5'-CAG TCT TCT GGG TGG CAG TGA T-3';parkin上游引物5'-CCA CGA TGC TCA ACT TGG CTA C-3'，下游引物5'-CAC GTC AAA CCA GTG ATC TCC C-3'。PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂凝膠電泳，儀器拍照并用相應(yīng)分析軟件測(cè)得各目的條帶光密度值(OD)，與內(nèi)參GAPDH 進(jìn)行比較，計(jì)算OD 比值，分析各時(shí)間點(diǎn)目的基因的表達(dá)情況。

1.2.4 Western blot 檢測(cè)parkin、LC3 I 和II 的表達(dá)變化 同前收集各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液冰上裂解30 min，再4℃，14 000 r/min 離心30 min，取上清，此為細(xì)胞總蛋白。BCA 法蛋白定量后加入上樣緩沖液后煮沸5 min。各取30 μg 總蛋白經(jīng)SDSPAGE 電泳，再轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。然后用5%脫脂奶粉/TBST 室溫下封閉2 h，分別用β-actin 抗體(1∶1 000)、parkin 抗體(1∶500)和LC3 抗體(1∶1 000)4℃搖床過(guò)夜孵育(12～24 h)。TBST 洗10 min×3 次，再對(duì)應(yīng)加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶10 000)室溫孵育1～2 h，TBST 洗10 min ×5次。用ECL 試劑盒進(jìn)行顯影曝光。采用凝膠分析軟件測(cè)得各蛋白條帶光密度值(OD)，并與內(nèi)參βactin 進(jìn)行比較，計(jì)算出OD 比值，分析各組各時(shí)間點(diǎn)目的蛋白表達(dá)情況。

1.2.5 細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)parkin 在巨噬細(xì)胞中分布 將小鼠腹腔巨噬細(xì)胞加入預(yù)先放有無(wú)菌蓋玻片的24 孔板中，去除懸浮細(xì)胞培養(yǎng)4 h，制備細(xì)胞爬片。加入200 ng/ml LPS 作用6 h，取出細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS 洗3 ×5 min，0.3% Triton X-100 室溫作用10 min 進(jìn)行細(xì)胞膜通透，PBS 清洗，10%小牛血清37℃封閉1 h，1∶100 稀釋的parkin 抗體4℃冰箱孵育24 h，PBS 洗3 ×5 min，F(xiàn)ITC 標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗37℃避光孵育1 h，PBS 洗5 ×5 min，用激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。

1.2.6 細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)parkin、LC3 和線粒體三者共定位 同前述方法制備細(xì)胞爬片，處理細(xì)胞。孵育一抗時(shí)，同時(shí)加入parkin 抗體(1∶100 稀釋)和LC3 抗體(1∶100 稀釋)，4℃冰箱孵育24 h，PBS 洗3 ×5 min，再同時(shí)加入parkin 二抗(Cy3 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，1∶100 稀釋)和LC3 二抗(Alexa Fluor 647標(biāo)記山羊抗兔IgG，1∶100 稀釋)，37℃避光孵育1 h，PBS 洗5 × 5 min，最后用MitoTracker Green(100 nmol/L)標(biāo)記線粒體，室溫30 min，PBS 洗5 ×5 min。用激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用IBM SPSS Statistics 19 統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用±s 表示，各時(shí)間點(diǎn)間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 巨噬細(xì)胞經(jīng)LPS 刺激后，線粒體膜電位呈下降趨勢(shì) JC-1 是線粒體的一種特異性染料，在線粒體膜電位正常時(shí)為聚合物(J-aggregates)，呈橘紅色，若線粒體發(fā)生損傷，膜電位下降后，JC-1 則變成單體(monomer)，呈綠色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體紅光和綠光比例可檢測(cè)線粒體損傷情況。巨噬細(xì)胞在經(jīng)LPS(200 ng/ml)刺激0、3、6、12、18 h 和24 h 后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果如圖1 所示:巨噬細(xì)胞線粒體膜電位隨LPS 作用時(shí)間延長(zhǎng)呈持續(xù)下降趨勢(shì)，膜電位下降的線粒體與正常線粒體的比例由刺激前的4.02%±0.18%增加到刺激24 h 后的25.43%±0.37%，表明巨噬細(xì)胞經(jīng)LPS 刺激后存在線粒體損傷，且隨作用時(shí)間延長(zhǎng)損傷加劇。

2.2 parkin 在巨噬細(xì)胞經(jīng)LPS 刺激前后的表達(dá)變化 為了解parkin 在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)情況，應(yīng)用200 ng/ml LPS 分別作用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞0、6、12 h 和24 h，通過(guò)RT-PCR 和Western blot 分別檢測(cè)parkinmRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示:巨噬細(xì)胞在LPS 刺激后，parkin 在蛋白水平表達(dá)明顯增多，至刺激后12 h 達(dá)到最高峰(圖2);parkin mRNA 表達(dá)水平增加不明顯(結(jié)果未顯示)。

圖1 LPS(200 ng/ml)作用巨噬細(xì)胞后線粒體膜電位變化情況Fig.1 Changes in mitochondrial membrane potential of murine peritoneal macrophages induced by LPS(200 ng/ml)

2.3 LPS 刺激前后，parkin 在巨噬細(xì)胞內(nèi)的定位情況 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞在200 ng/ml LPS 刺激6 h后，利用細(xì)胞免疫熒光法標(biāo)記parkin，DAPI 染細(xì)胞核，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)parkin 在巨噬細(xì)胞中的分布情況。結(jié)果顯示:巨噬細(xì)胞在未受刺激狀態(tài)下，parkin 均勻分布在細(xì)胞質(zhì)中，在LPS 刺激后parkin 形成聚集體，呈斑點(diǎn)狀聚集分布在細(xì)胞中(圖3)。

2.4 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞在LPS 刺激后LC3 的表達(dá)水平 自噬體形成時(shí)，胞漿LC3 的羧基端會(huì)被酶解掉一小段多肽產(chǎn)生LC3 Ⅰ，LC3 Ⅰ羧基端的甘氨酸與磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合產(chǎn)生LC3 Ⅱ，被招募并定位在自噬體膜的內(nèi)外表面。通過(guò)Western blot 檢測(cè)LC3 Ⅱ的蛋白水平以及LC3 Ⅱ和LC3 Ⅰ比值大小可評(píng)估自噬發(fā)生的程度。用200 ng/ml LPS 分別作用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞0、6、12 h 和24 h，Western blot檢測(cè)LC3 Ⅰ和Ⅱ的表達(dá)水平，結(jié)果顯示:在LPS 刺激后，巨噬細(xì)胞LC3 Ⅱ的表達(dá)隨刺激時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增多，LC3 Ⅱ/Ⅰ比值也增大，表明LPS 導(dǎo)致巨噬細(xì)胞發(fā)生自噬(圖4)。

圖2 LPS(200 ng/ml)作用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞后parkin表達(dá)水平Fig.2 Expression of parkin protein in murine peritoneal macrophages induced by LPS (200 ng/ml)

圖3 parkin 在巨噬細(xì)胞中的分布情況Fig.3 Distribution of parkin in murine peritoneal macrophages

圖4 LPS(200 ng/ml)作用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞后LC3 Ⅱ與LC3 Ⅰ蛋白比例變化情況Fig.4 Expressions of LC3 Ⅱand LC3 Ⅰprotein in murine peritoneal macrophages induced by LPS (200 ng/ml)

圖5 Parkin、線粒體和自噬體三者在細(xì)胞中存在共定位情況，LPS(200 ng/ml)作用巨噬細(xì)胞6 hFig.5 Co-localization of parkin，mitochondria and LC3 in murine peritoneal macrophages when stimulated with LPS(200 ng/ml)after 6 h

2.5 LPS 刺激后，巨噬細(xì)胞內(nèi)parkin、LC3 和線粒體存在共定位關(guān)系 LPS 刺激巨噬細(xì)胞后，存在線粒體損傷、細(xì)胞自噬，同時(shí)parkin 由均勻分布轉(zhuǎn)成向明顯的斑點(diǎn)狀聚集。為探討三者之間可能存在的相互作用，在200 ng/ml LPS 作用巨噬細(xì)胞6 h 后，分別用三種不同熒光染料標(biāo)記parkin、線粒體和LC3，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)三者的共定位情況，結(jié)果顯示:LPS 刺激后，巨噬細(xì)胞內(nèi)parkin、線粒體和LC3存在共定位，表明parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬形成(圖5)。

3 討論

病原微生物入侵機(jī)體后，巨噬細(xì)胞借助其表面模式識(shí)別受體、Fc 受體和補(bǔ)體受體等首當(dāng)其沖對(duì)病原微生物做出快速反應(yīng)，是參與固有免疫應(yīng)答的重要效應(yīng)細(xì)胞。巨噬細(xì)胞通過(guò)分泌多種酶類(lèi)、細(xì)胞因子和反應(yīng)性氧中間物等參與炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展。巨噬細(xì)胞釋放的多種生物活性物質(zhì)可以限制病原體的侵害，但過(guò)度的炎癥反應(yīng)也可造成機(jī)體損傷。

線粒體在調(diào)控細(xì)胞凋亡、能量代謝方面起著重要作用，在機(jī)體受到病原微生物感染時(shí)，由于缺血、缺氧和過(guò)度炎癥應(yīng)答常導(dǎo)致多種組織細(xì)胞線粒體功能改變及線粒體膜電位的降低［5］。線粒體膜電位降低可促進(jìn)mtROS 產(chǎn)生及線粒體DNA 釋放到胞質(zhì)，從而誘導(dǎo)NLRP3 炎癥小體的活化［6，7］。同時(shí)，NLRP3 炎癥體活化又促進(jìn)mtDNA 的釋放，致使線粒體進(jìn)一步損傷。受損線粒體需要及時(shí)清除，以保證細(xì)胞正常生命活動(dòng)的進(jìn)行［8］。線粒體自噬就是將多余或損傷線粒體與溶酶體結(jié)合進(jìn)行自噬選擇性清除的過(guò)程［9］。

本研究首先應(yīng)用脂多糖作用于小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)脂多糖可導(dǎo)致巨噬細(xì)胞線粒體膜電位降低，表明線粒體在巨噬細(xì)胞對(duì)內(nèi)毒素應(yīng)答中起到一定作用，這與Arnoult 等［10］研究結(jié)果相一致。巨噬細(xì)胞在對(duì)內(nèi)毒素應(yīng)答中會(huì)導(dǎo)致線粒體損傷，如不能及時(shí)清除損傷線粒體，可能會(huì)進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)。Parkin 及其介導(dǎo)的線粒體自噬在對(duì)損傷或多余線粒體的選擇性清除過(guò)程中發(fā)揮重要作用［11］。Narendra等［3］研究顯示，HEK293 和Hela 細(xì)胞在加入CCCP引起線粒體損傷后，parkin 能夠被選擇性募集至線粒體膜電位降低的線粒體，而使胞質(zhì)中parkin 降解減少，parkin 在細(xì)胞中表達(dá)相對(duì)增多，并通過(guò)E3 泛素連接酶活性介導(dǎo)這些損傷的線粒體經(jīng)自噬體途徑清除，以減少對(duì)細(xì)胞的損傷。本研究利用RT-PCR和Western blot 的方法檢測(cè)了parkin 在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)毒素應(yīng)激中的表達(dá)變化，結(jié)果顯示parkin在mRNA 水平變化不明顯，但在蛋白水平表達(dá)明顯增多，表明parkin 在胞質(zhì)中降解減少，提示parkin 可能通過(guò)蛋白水平的變化發(fā)揮相應(yīng)的作用。對(duì)parkin在巨噬細(xì)胞受到脂多糖刺激前后分布的研究表明，巨噬細(xì)胞在未受刺激狀態(tài)下parkin 在胞質(zhì)中均勻分布，而脂多糖刺激后則轉(zhuǎn)變成明顯的點(diǎn)狀聚集;同時(shí)對(duì)自噬相關(guān)蛋白LC3 Ⅱ及LC3 Ⅰ表達(dá)變化的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞在受到LPS 刺激后發(fā)生明顯的自噬，與張梅等［12］在巨噬細(xì)胞系RAW264.7 中的研究結(jié)果一致。進(jìn)一步對(duì)parkin、LC3 及線粒體共定位分析的結(jié)果顯示，parkin 參與了巨噬細(xì)胞對(duì)清除損傷線粒體的線粒體自噬發(fā)生，表明其可能在巨噬細(xì)胞參與的炎癥反應(yīng)中起到一定的調(diào)控作用。

本研究深入探討了小鼠腹腔巨噬細(xì)胞在內(nèi)毒素刺激下parkin 的表達(dá)變化及其介導(dǎo)的線粒體自噬形成，提示parkin 可能通過(guò)介導(dǎo)線粒體自噬方式參與巨噬細(xì)胞對(duì)內(nèi)毒素應(yīng)激所致炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用。為進(jìn)一步明確parkin 在巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用及機(jī)制，更深入的實(shí)驗(yàn)可通過(guò)基因轉(zhuǎn)染及RNA 干擾技術(shù)調(diào)控parkin 的表達(dá)，并觀察其對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥因子釋放的影響，為完善炎癥反應(yīng)調(diào)控的可能途徑提供新的思路。

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