譚家余 陳敬林 黃 湘③ 李冬秀 袁春雷 萬志丹

(南方醫(yī)科大學附屬中山市博愛醫(yī)院中心ICU，中山 528403)

人金屬硫蛋白(Metallothionein，MT)定位于16q13 上，是一類在生物界中普遍存在的，富含半胱氨酸、可結(jié)合7 個二價金屬離子的多肽鏈，其分子量約為6 000～7 000 kD［1］。在哺乳類動物中，已發(fā)現(xiàn)四個MT 組分:MT-1、MT-2、MT-3 及MT-4。這些組分主要編碼10 個有功能的亞型及7 個無功能的亞型［2，3］，其中MT-2A 是MT-Ⅱ亞型中唯一一個具有生物學作用的蛋白質(zhì)［4］。本研究構建攜帶HIS 標簽的真核表達載體pCDNA 3.1-MT2A，并將其轉(zhuǎn)染至293T 和SMMC7721 細胞株，旨在對MT2A 在細胞內(nèi)的表達和定位進行初步的研究。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 pcDNA3.1(+)質(zhì)粒載體購自life 公司;293T 和SMMC7721 細胞株、anti-HIS 鼠抗、蛋白Marker、DH5α 菌株購自鐘鼎生物;FITC 標記的羊抗鼠二抗購自Rockland 公司;DNA 膠純化試劑盒、質(zhì)粒小提取試劑盒購自AXYGEN 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 載體構建 使用基因合成的方法合成基因MT2A，在N 端添加了Kozak 序列及His 標簽序列，擴增片段大小為216 bp，將擴增后的目的基因雙酶切連接至pcDNA3.1(+)載體的BamH Ⅰ和Not Ⅰ之間。次日將全部的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α 菌株，挑取陽性克隆至液體培養(yǎng)基作震蕩培養(yǎng)，堿裂解法小量提取和純化質(zhì)粒，用雙酶切電泳后，進一步測序鑒定。

1.2.2 細胞準備 首先準備蓋玻片，酸浸泡，用清水清洗干凈，然后泡在75%的酒精，用時將蓋玻片用酒精燈燒干，放入六孔板中;消化細胞，棄掉原有的培養(yǎng)基，加入2 ml 的PBS 沖洗一遍，棄掉，加入0.25%的胰酶消化至細胞變圓，棄掉，加入完全培養(yǎng)基吹打至細胞被吹散，移到蓋玻片上，使得細胞密度為60%～70%。

1.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 取pCDNA3.1-MT2A-HIs 質(zhì)粒1 μg 稀釋到250 μl 的無血清培養(yǎng)基中，Lipo 2000 5 μl稀釋到250 μl 的無血清培養(yǎng)基中，混勻，室溫放置5 min，然后將稀釋的質(zhì)粒加入到Lipo 2000 中混勻，室溫放置20 min，這期間將細胞用PBS 洗兩遍后，加入1.5 ml 的無血清培養(yǎng)基。20 min 后將質(zhì)粒與Lipo 2000 混合物滴入細胞中，放置37℃培養(yǎng)5 h，5 h換為完全培養(yǎng)基。

1.2.4 激光共聚焦定位 ①固定:細胞轉(zhuǎn)染36 h后棄去原有培養(yǎng)基，PBS 洗兩遍，加入1 ml 3.7%多聚甲醛，室溫固定20 min;②透化:棄去多聚甲醛，PBS 洗三遍，加入1 ml 0.5% TritonX-100 4℃透化10 min;③封閉:棄去透化液，PBS 洗三遍，加入3%BSA 封閉液，37℃1～4 h;④一抗:將40 μl 配置好的一抗(anti-HIS 1∶800 稀釋)滴到封口膜上，將蓋玻片的細胞面蓋到一抗上，避免產(chǎn)生氣泡，然后放入濕盒中，4℃過夜;⑤二抗:一抗孵育完成后，將玻片重新放到6 孔板中，PBS 洗三遍，每次10 min，然后孵育二抗(FITC 標記的羊抗鼠二抗1∶25 標記)，方法同4;⑥染核:二抗孵育完成后，將玻片重新放到6孔板中，PBS 洗三遍，每次15 min，然后1∶2 000 稀釋DAPI(4，6-二脒基-2-苯基吲哚)加入到6 孔板中，室溫3 min，PBS 洗三遍，每次15 min;⑦封片:PBS配置10%甘油，滴至載玻片上，將蓋玻片細胞面朝下放置到載玻片上，避免產(chǎn)生汽包，然后四周用指甲油封閉;⑧共聚焦顯微鏡觀察:將做好的片子置于激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 真核表達載體的鑒定 pCDNA3.1-MT2A-HIS重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)粒抽提，BamHI 和NotI 雙酶切后產(chǎn)生約200 bp(MT2A 目的基因片段長度為216 bp)和5 500 bp［pCDNA3.1(+)空載體片段長度為5 428 bp］的兩條條帶，實驗結(jié)果與預期目的片段大小一致(圖1)。

2.2 陽性克隆測序及比對 挑取陽性克隆子測序，紫紅色顯示為設計的酶切位點，雙劃線區(qū)域為His-Tag 序列，單劃線區(qū)域為MT2A 基因區(qū)域，插入片段的測序結(jié)果與MT2A 全長序列完全一致(圖2)。陽性克隆子測序結(jié)果與設計的目的片段預期序列進行比對，100%匹配，截取部分比對序列如下(圖3)。由圖可見，經(jīng)測序及比對鑒定，插入的目標片段完全正確。

圖1 pCDNA3.1(+)-MT2A 質(zhì)粒酶切產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.1 Digestion products of pCDNA3.1(+)-MT2A plasmid of gel electrophoyresis

圖2 pCDNA3.1(+)-MT2A 質(zhì)粒插入片段的測序圖Fig.2 Sequencing map of inserted fragment of pCDNA3.1-MT2A plasmid

圖3 pCDNA3.1(+)-MT2A 質(zhì)粒插入片段與預期序列的部分比對圖Fig.3 Part of sequencing figure of inserted fragment of pCDNA3.1-MT2A that compared with expected sequencing figure

圖4 MT2A 在293T 和SMCC7721 細胞中的定位(×100)Fig.4 Location of MT2A in 293T and SMCC7721 cell lines(×100)

2.3 激光共聚焦顯微鏡觀察MT2A 在細胞中的定位 pCDNA3.1(+)-MT2A 真核表達載體轉(zhuǎn)入293T 和SMCC7721 細胞系后，用激光共聚焦顯微鏡觀察MT2A 在真核細胞內(nèi)的定位。如圖4 所示，圖中藍色熒光顯示的為DAPI 染色的細胞核，綠色熒光顯示的為MT2A 蛋白。由圖可見，MT2A 主要表達于293T 和SMCC7721 細胞的胞質(zhì)中，核內(nèi)未見明顯表達。

3 討論

人MT2A 基因cDNA 序列全長共186 個堿基對，編碼的MT2A 蛋白含62 個氨基酸，其中約三分之一的氨基酸是半胱氨酸，其巰基可以和金屬離子可逆結(jié)合。研究發(fā)現(xiàn)MT-2A 不僅具有抗輻射、重金屬解毒、清除自由基、修復組織損傷、調(diào)節(jié)微量元素平衡及抗衰老作用，還與細胞的增殖、凋亡、多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展及腫瘤耐藥密切相關［5-7］。大量的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中MT-2A 的高表達與腫瘤的惡性程度及浸潤深度呈正相關。文獻［7］綜述報道:肺癌、鼻咽癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、白血病、食管癌、非霍奇金淋巴瘤中MT-2A 蛋白(或MT-2A mRNA)的表達均增加。也有文獻報道，在肝癌和胃癌中，MT-2A 的表達降低［8-10］。最新的研究還發(fā)現(xiàn)MT-2A 基因多態(tài)性與波蘭人群乳腺癌的發(fā)病風險有關［11］。

蛋白質(zhì)的表達具有時間和空間特異性，大量研究顯示同一種蛋白質(zhì)在不同的細胞中有不同的表達，而同一種蛋白在細胞的不同部位表達，其功能也可能不同。因而闡明蛋白質(zhì)在不同細胞或不同生理、病理狀態(tài)下的表達定位情況將為其功能研究提供重要線索和理論依據(jù)。2003 年Moon 等［12］報道survivin 蛋白從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細胞核可能構成原發(fā)性肝癌細胞增殖和分化的重要調(diào)控機制。Solomon等［13］指出，maspin 蛋白在卵巢癌細胞的胞核內(nèi)高表達比在胞質(zhì)內(nèi)高表達，其生存期要明顯延長。Lonardo 等［14］在肺癌研究中也得到類似結(jié)論。

MT2A 蛋白在細胞內(nèi)為胞質(zhì)蛋白，主要存在于細胞質(zhì)［15］。李新穎等［16］報道了人MT2A 蛋白在COS-7 細胞內(nèi)呈斑點狀分布且主要分布在細胞質(zhì)中，核內(nèi)未見明顯表達。Zhou 等［17］研究MT 在化療藥物阿霉素中的解毒作用時發(fā)現(xiàn)，細胞質(zhì)MT 可阻止阿霉素誘導的脂質(zhì)過氧化和對相鄰細胞器的破壞;細胞核的MT 可抑制阿霉素介導的DNA 損傷。

本研究以HIS 為標記物，構建攜帶HIS 標簽的pCDNA3.1-MT2A 重組質(zhì)粒的真核表達載體，分析MT2A 蛋白在293T 和SMCC7721 細胞株中的表達和定位情況。激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，成功轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-MT2A-HIS 重組質(zhì)粒的細胞內(nèi)，可見到綠色熒光環(huán)繞于細胞核均勻分布于胞質(zhì)中，核內(nèi)未見明顯表達。本研究證實了MT2A 在細胞內(nèi)為胞質(zhì)蛋白，其在正常細胞株(293T)和癌細胞株(SMCC7721)的定位相同，但并不是在所有細胞中均檢測到MT2A 的表達，考慮可能是因為重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率以及細胞處于不同的發(fā)育周期而造成的差異。本研究為進一步探討MT2A 在肝癌細胞內(nèi)的功能奠定了基礎。

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