丁 晨，張仲文，聶慶虎

改良直接貼壁法體外分離培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其鑒定

丁 晨1，張仲文2，聶慶虎2

目的觀察并鑒定兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物特性，建立一套簡單、高效的培養(yǎng)方法。方法采用直接貼壁法分離培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)。MTT法測定其增殖水平并繪制其生長曲線。流式細(xì)胞儀測定第三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表型。結(jié)果細(xì)胞培養(yǎng)第5 d，鏡下見細(xì)胞呈小集落生長，形態(tài)呈多邊形；7～8 d小集落融合成大集落，10 d左右可傳代。第二代細(xì)胞鏡下呈梭形成纖維樣細(xì)胞，即間充質(zhì)干細(xì)胞；細(xì)胞生長曲線成S形；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表達CD 73、CD 90、CD 105、不表達CD 34、CD 45。結(jié)論改良直接貼壁法可獲得大量、純化、穩(wěn)定的間充質(zhì)干細(xì)胞。

直接貼壁法;兔;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)是一類存在于骨髓中、具有高度自我更新和多向分化潛能的干細(xì)胞[1]。在一定條件下，BMSCs能分化成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞等[2]。BMSCs來源廣泛，容易獲得，易于培養(yǎng)，如今已成為組織細(xì)胞工程領(lǐng)域內(nèi)常用的種子細(xì)胞[3～5]。本研究旨在探索兔BMSCs體外分離、培養(yǎng)、純化和增殖的最佳條件，并進行相關(guān)檢測。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 4～5個月齡健康新西蘭大耳兔8只，普通級，體重2.0～3.0 kg，雌雄不限，由解放軍總醫(yī)院提供。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 DMEM/F12 培養(yǎng)液(HyClone)；胰蛋白酶(GiBco)；胎牛血清(HyClone)；四甲基偶氮唑鹽(MTT，Sigma)；二甲基亞砜(DMSO，Sigma)；青-鏈霉素雙抗(HyClone)

1.2.2 儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱(上海)；雙人單面超凈工作臺(安泰VS-1300L-U)；低溫高速離心機(美國貝克曼J-26XP)；恒溫振蕩培養(yǎng)箱(中國，THZ-95)；普通光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯)；倒置熒光顯微鏡(日本奧林巴斯)；酶標(biāo)儀(美國貝克曼DTX-880)

1.3 方法

1.3.1 BMSCs的分離和原代培養(yǎng) 取新西蘭大耳兔1只，稱重后全身麻醉，固定于手術(shù)臺上，髂骨處備皮、消毒，無菌條件下使用16號骨髓穿刺針于髂骨處穿刺，用5 ml無菌注射器(內(nèi)含3000 U肝素)抽取骨髓約4 ml。將抽取的骨髓全部移入15 ml離心管中，加入等量PBS混勻，以1500 r/min離心3 min，棄去上清，約有2 ml的骨髓沉淀，加入5 ml含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)(0.07 ml， 0.01 U/ml的青鏈霉素)，充分吹打均勻，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5% CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第3天半量換液，第5天全量換液，并用PBS輕輕震蕩清洗1次，去除雜質(zhì)。以后每2～3 d半量換液一次。

1.3.2 BMSCs的傳代和擴增 原代培養(yǎng)10 d左右，倒置顯微鏡觀察到BMSCs生長融合達到80%～90%。棄去全部培養(yǎng)，PBS沖洗2次，用2 ml 0.25%胰蛋白酶消化2～3 min，倒置顯微鏡觀察到細(xì)胞形態(tài)開始皺縮，間隙增大，呈漂浮狀態(tài)時加入3 ml培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打數(shù)次，以1300 r/min離心3 min，棄上清，加入10 ml含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，以1∶2傳代培養(yǎng)，分別記為A瓶和B瓶，A瓶培養(yǎng)基中不添加雙抗，B瓶培養(yǎng)基中添加0.05 ml(0.01 U/ml)的青鏈霉素。A瓶換液及其傳代所用培養(yǎng)基都不再添加抗生素，記為無抗生素組；B瓶換液及其傳代所用培養(yǎng)基添加抗生素，記為抗生素組。每2 d或3 d半量換液1次，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并做記錄。

1.3.3 BMSCs生長曲線的測定 MTT法測定兔BMSCs的生長曲線：取生長達80%～90%融合的第3代MSCs，0.25%胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液，1300 r/min離心5 min，以2×104/ml的密度接種于96孔板，每孔接種100 μl，置37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5% CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天固定時間取出96孔板，選擇其中12孔加入MTT 10 μl，37 ℃培養(yǎng)4 h后吸出上清并加入150 μl DMSO，置脫色搖床上低速振蕩10 min,酶聯(lián)免疫檢測儀在波長490 nm處測量各孔的吸光度值，取平均值，共測量8次。無抗生素組和抗生素組均測量4組。

1.3.4 BMSCs活力測定 取原代到第7代傳代細(xì)胞。0.25%胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，濃度1×105/ml，以0.4%臺盼藍(lán)作染色劑，用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，共計數(shù)5次，取其平均值，計算細(xì)胞活力：活細(xì)胞率(%)=活細(xì)胞/(活細(xì)胞+死細(xì)胞)×100%[6]。

1.3.5 BMSCs細(xì)胞表面標(biāo)記物鑒定 細(xì)胞生長接近90%左右融合時，取第五代生長良好的細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化后，PBS沖洗兩遍，并制備成5×105/ml濃度的單細(xì)胞懸液，取0.1 ml細(xì)胞懸液置于不同離心管中，各離心管分別加入CD 90、CD 73、CD 105、CD 45/34/11b/19/HLA-DR的一抗，室溫反應(yīng)30 min后，PBS洗滌兩遍后與FITC標(biāo)記的二抗避光反應(yīng)30 min，將洗滌后的細(xì)胞重懸于PBS中，作為流式細(xì)胞分析用。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 原代細(xì)胞接種3 d后首次半量換液，可見少量多角形單個核細(xì)胞貼壁生長。5 d首次全量換液，PBS溶液輕輕洗滌2次，去除大量雜質(zhì)后可見MSCs呈集落樣生長，細(xì)胞逐漸變?yōu)殚L梭形，胞核呈圓形或橢圓形，胞漿可見顆粒樣物質(zhì)。7～8 d細(xì)胞生長迅速，小集落融合成大集落。10～12 d細(xì)胞達95%以上融合，細(xì)胞形態(tài)為長梭形，緊密排列，呈漩渦狀。細(xì)胞再行傳代培養(yǎng)后，形態(tài)更加均一，增殖速度明顯加快，5 d即能達到80%～90%融合。第1代細(xì)胞A瓶無抗生素組培養(yǎng)5 d后細(xì)胞生長情況(圖1)；B瓶有抗生素組培養(yǎng)5 d后細(xì)胞生長情況(圖2)。兩者比較發(fā)現(xiàn)，A瓶有更多細(xì)胞貼壁生長，增殖也更迅速。

2.2 BMSCs生長曲線測定 MTT法測定第3代細(xì)胞生長曲線，細(xì)胞消化種板后，在24 h內(nèi)兩組細(xì)胞生長增殖均不明顯，處于潛伏期；之后均進入對數(shù)生長期快速生長，無抗生素組細(xì)胞進入對數(shù)生長期的時間早于抗生素組，峰值也高于抗生素組；兩組均在6～7 d進入平臺期(圖3、4)。

2.3 BMSCs活力測定 兩組細(xì)胞原代至第3代細(xì)胞存活率基本相同，從第4代開始細(xì)胞活力下降，第6代開始下降明顯，第7代最低。從第1代開始，無抗生素組細(xì)胞的存活率高于抗生素組(圖5、6)。

2.4 流式細(xì)胞鑒定結(jié)果分析 經(jīng)鑒定，兔BMSCs表面抗原CD90表達率100%，CD105表達率99.22%，CD73表達率99.99%，呈陽性；CD45/34/11b/19/HLA-DR(0.50%)，呈陰性，基本不表達，由此證明本研究培養(yǎng)的細(xì)胞是約99%為MSCs(圖7)。

3 討 論

相比軟骨細(xì)胞，BMSCs更容易獲得，對捐獻者的傷害比較小，容易增殖，BMSCs已成為組織工程學(xué)研究的熱點。BMSCs具有強大的多能性和分化能力。獲得BMSCs的方法有很多，目前比較常用的有密度梯度離心法、直接貼壁法、流式細(xì)胞儀分離法及免疫磁珠分離法[7]。密度梯度離心法主要根據(jù)骨髓中各細(xì)胞成分的比重不同，分離提取單個核細(xì)胞進行貼壁培養(yǎng)。此法獲得的原代BMSCs純度高，但貼壁細(xì)胞量少、活性低，細(xì)胞融合時間長。流式細(xì)胞儀分離法是根據(jù)BMSCs體積小，相對缺少顆粒的特性進行分選[8]。免疫磁珠分離法是根據(jù)BMSCs表達的某些細(xì)胞表面標(biāo)志物進行收集或根據(jù)其表面負(fù)表達的抗原進行負(fù)篩選[9]。這兩種方法獲得的BMSCs純度高，但BMSCs數(shù)量少，活性低，且成本高，技術(shù)難，所以應(yīng)用不多。

本研究采用直接貼壁法分離BMSCs。此法根據(jù)BMSCs貼壁生長，造血系細(xì)胞懸浮生長的特性，采用半保留換液，即原代培養(yǎng)3 d后輕輕吸取上層培養(yǎng)基，再加入相同量的新鮮培養(yǎng)基，這樣即去除了雜質(zhì)和不貼壁細(xì)胞，又保證了細(xì)胞生長所需要的營養(yǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，采用直接貼壁法分離、純化MSCs，經(jīng)過2次傳代培養(yǎng)后，其細(xì)胞純度達95%～98%。

從BMSCs的生長曲線可以看出，BMSCs體外培養(yǎng)需經(jīng)過3個生長時期，即潛伏期，對數(shù)生長期和平臺期。不同代次的細(xì)胞活力不同，原代到第3代，傳代次數(shù)越多，細(xì)胞增殖能力越強，從第3代開始，隨著傳代次數(shù)增多，細(xì)胞增殖能力逐漸減弱，這可能與細(xì)胞的老化有關(guān)。本次試驗所采用的培養(yǎng)方法和其他傳統(tǒng)方法相比，有一個改進的地方：在原代培養(yǎng)時在培養(yǎng)基中添加雙抗，這能抑制細(xì)菌生長，防止污染，但同時也抑制了間充質(zhì)干細(xì)胞的活力，影響其生長和增殖。從第1代開始不再添加雙抗，這利于細(xì)胞的生長、增殖。實驗證明，這種培養(yǎng)方法不但前期降低了污染的發(fā)生率，而且提高了細(xì)胞的生長、增殖速率。

BMSCs無特異性標(biāo)志物分子，因此，無直接的鑒別BMSCs的方法。通過對培養(yǎng)中的分化型的BMSCs進行實驗室鑒定，然后推知是否是BMSCs[10]。在MSCs的表面分子中，CD34必須呈陰性表達[11]。因此，當(dāng)前在行流式細(xì)胞儀分離法時，一般首先排除BMSCs不表達的造血細(xì)胞表面抗原，如造血前體細(xì)胞標(biāo)志抗原CD34，白細(xì)胞標(biāo)志抗原CD45等；再檢測BMSCs表達陽性的細(xì)胞表面標(biāo)志物，如CD13、CD29、CD73、CD90、CD105等[12]由于本研究體外培養(yǎng)的BMSCs高效表達CD90、CD105、CD73，不表達造血系細(xì)胞的CD34、CD45等分子，因此，多采用排除法鑒定BMSCs。本研究對第五代細(xì)胞做流式細(xì)胞鑒定結(jié)果顯示，CD90、CD105、CD73為陽性， CD34、CD45為陰性，證明本研究培養(yǎng)的細(xì)胞是BMSCs。

綜上所述，本研究采用改良的直接貼壁法獲得了大量、純化、穩(wěn)定的BMSCs，建立了一套簡單易行，成本低廉的BMSCs體外分離、培養(yǎng)的方法，為進一步的研究打下了基礎(chǔ)。

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(2013-11-11收稿 2014-02-27修回)

(責(zé)任編輯 岳建華)

Invitroisolationandcultureofrabbitbonemarrowmesenchymalstemcellsusingdirectlyadherentmethod

DING Chen1, ZHANG Zhongwen2, and NIE Qinghu2. 1. Graduate School Xuzhou Medical College, Xuzhou 221004, China; 2. 4th Orthopedics Department, General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Beijing 100039, China

ObjectiveTo observe and identify the biological characteristics of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells, and establish a set of simple , viable culture methods.MethodsRabbit bone marrow mesenchymal stem cells were extracted through adherent method directly, and use the inverted microscope to observe period morphology. The value-added level of the cells was assayed by MTT and the growth curve was drawn.The third passage of bone marrow mesenchymal stem cell phenotypes were measured by flow cytometry.ResultsUnder the microscope,cells were small colony growth with shape of polygons when cells were cultured at the 5th day.Small colony confluent colony at 7-8 th day.The cells could be passaged at about 10th day.The second passage of cells showed long fusiform and fibroblast-like growth,that means marrow mesenchymal stem.The cell growth curve was S-shaped.Flow cytometry results showed that the cells expressed CD 73，CD 90，CD 105, and did not express CD 34,CD 45.ConclusionsThe directly adherent method can get apundant, purified, and stable mesenchymal stem cells .

directly adherent method;rabbits;bone mesenchymal stem cells

丁 晨，在讀研究生，E-mail: dcyang622@163.com

1. 221004，徐州醫(yī)學(xué)院；2. 100039北京，武警總醫(yī)院骨四科

張仲文，E-mail: zzwen3@gmail.com

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