付 強，莫 玲，苗立中，王 艷，李金林(山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600)

肉毒中毒是由肉毒毒素(BoNTs)引起的一種致死性的神經(jīng)麻痹性疾病。肉毒毒素是革蘭氏陽性的肉毒梭狀芽孢桿菌在厭氧環(huán)境下產(chǎn)生的一種外毒素。它是人類目前已知的毒素中毒力最強的毒素［1］，其毒性是氰化鉀的10 000倍，對人的最小致死量約為0.1 μg。根據(jù)毒素抗原性不同，肉毒桿菌分為7 型:A、B、C、D、E、F、G 型，其中引起人類疾病的是A、B、E和F型，以A型肉毒桿菌產(chǎn)生的毒素毒性最強;C型和D型毒素主要引起畜禽和野鳥中毒。

各血清型BoNT的結(jié)構(gòu)基本相同，均是由輕鏈(LC)和重鏈(HC)2個亞單位靠二硫鍵相連組成的雙鏈結(jié)構(gòu)，Hc為產(chǎn)生最佳免疫保護效果的最小毒素片段，是肉毒毒素疫苗研究的靶抗原。傳統(tǒng)類毒素疫苗需要培養(yǎng)大量肉毒梭菌來提取肉毒毒素，再經(jīng)甲醛(福爾馬林)滅活，制備過程安全性較低。隨著肉毒毒素表位及保護性抗原研究的深入，制備無毒性毒素保護性抗原片段(即重組毒素rHc片段)作為候選疫苗，會使疫苗安全性大大提高［2］。通過基因重組技術(shù)，能夠?qū)Hc片段在大腸桿菌或酵母表達系統(tǒng)中進行大規(guī)模表達，制備的疫苗免疫攻毒試驗可獲得良好效果。

1 大腸桿菌表達肉毒毒素抗原

大腸桿菌表達系統(tǒng)可有效表達異源蛋白，具有遺傳背景清楚、培養(yǎng)操作簡單、轉(zhuǎn)化效率高的優(yōu)點，多種活性蛋白通過此系統(tǒng)表達獲得，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療領(lǐng)域［3］。大腸桿菌表達外源蛋白有2種類型，可溶性和非可溶性(包涵體)，大多數(shù)研究人員更傾向于可溶性蛋白的表達，但存在易降解的缺點。

絕大多數(shù)肉毒重組抗原在大腸桿菌表達使用pET質(zhì)粒。這些質(zhì)粒攜帶T7啟動子和pBR322復(fù)制原點，蛋白表達能力強但可通過降低誘導(dǎo)物的濃度來削弱蛋白表達，以提高某些目的蛋白的可溶部分產(chǎn)量。也使用T5啟動子降低表達水平，從而增加了表達蛋白的可溶性，但此表達并非完全有效［4－5］。另外一種方法是使用融合標簽，研究表明某些高度可溶的蛋白質(zhì)在與其他易形成包涵體的蛋白質(zhì)融合后會促進融合蛋白質(zhì)以可溶形式表達。例如，谷胱甘肽S－轉(zhuǎn)移酶(GST)［6］、硫氧還蛋白(TRX)［7］和麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)［8］已被成功表達可溶性肉毒抗原，這些融合標簽將為進一步的蛋白濃縮、提純、檢測等提供便利，同時也可以有效抑制宿主蛋白酶的降解活性。

在規(guī)?；a(chǎn)中，需要通過工藝優(yōu)化來降低生產(chǎn)成本，傳統(tǒng)的LB肉湯、2YT和TB成分復(fù)雜不適合工業(yè)化生產(chǎn)。此外，肉湯培養(yǎng)基含有動物源蛋白成分，增加了朊病毒的風(fēng)險。選用M9培養(yǎng)基可用于肉毒抗原的生產(chǎn)［9－10］。培養(yǎng)基中的誘導(dǎo)劑控制啟動子誘導(dǎo)蛋白表達，最常用的誘導(dǎo)劑為IPTG，使用濃度范圍約0.05～1.00 mmol/L，優(yōu)化濃度僅在很少情況下確定，關(guān)鍵在于誘導(dǎo)時間。搖瓶培養(yǎng)初始誘導(dǎo)濃度(OD600)為0.5～0.8，極少數(shù)使用高的濃度。然而，在高密度培養(yǎng)條件下，誘導(dǎo)時OD600在分批發(fā)酵為10～20，補料培養(yǎng)可達到90左右［10］。此外，在工程菌中需要添加抗生素，以維持菌體質(zhì)粒的穩(wěn)定，其添加量會對外源蛋白表達產(chǎn)生影響。

溫度會影響菌體的代謝活性，進而影響蛋白表達。在蛋白表達的發(fā)酵培養(yǎng)中，一般分為2個階段，菌體增殖階段一般為大腸桿菌的最適溫度37℃，極少數(shù)報道為30℃［11］，而在誘導(dǎo)表達階段溫度選取各研究報道差異較大，但大體可分為為3種類型:低溫(16～18℃)、中溫(25～30℃)、正常溫度(37 ℃)［10－12］，隨著培養(yǎng)方式的不同，蛋白誘導(dǎo)時間也有差異，從3 h到30 h不等。

發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，菌體細胞需要處理以獲得純化的重組蛋白。當前多使用帶多聚組氨酸標簽(6×His－tag)的重組肉毒蛋白可以與Ni2+-NAT樹脂中的Ni2+螯合而得到快速純化。另外，離子交換、凝膠過濾等可結(jié)合親和色譜法進一步純化。在揺瓶誘導(dǎo)過程可獲得1～220 mg/L的表達蛋白，優(yōu)化各發(fā)酵條件的高密度培養(yǎng)(HCDC)工藝可極大提高rBoNT產(chǎn)量，一般分批發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)量為60 mg/L，但采用補料培養(yǎng)HCDC工藝，雖然表達時間僅有3 h，但rBoNT表達量達到468 mg/L［10］。

2 畢赤酵母表達肉毒毒素抗原

最早建立的用于外源蛋白生產(chǎn)的真核表達系統(tǒng)是釀酒酵母表達系統(tǒng)，其在食品工業(yè)中的應(yīng)用已有數(shù)千年的歷史，但釀酒酵母不適合高密度培養(yǎng)，外源基因表達水平較低。并不是表達外源基因的理想宿主菌，Ogata等1969年首次發(fā)現(xiàn)1種嗜甲醇酵母——巴斯德畢赤酵母，其強有力醇氧化酶(AOX1)基因啟動子，嚴格調(diào)控外源蛋白的表達。在甲醇為唯一碳源的條件下生長，可產(chǎn)生近30%的蛋白含量。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，已從最初用于畢赤酵母表達的野生型菌株NRRL-Y-11430改造衍生出多種用于外源蛋白表達的畢赤酵母菌株，如組氨酸缺陷型菌株GS115、KM71和MC100-3。

因為甲醇具有毒性、易燃，在食品和醫(yī)療領(lǐng)域中的使用受到限制，現(xiàn)已改造出多種不需要甲醇為唯一誘導(dǎo)劑的啟動子，如GAP啟動子和GCW14啟動子［13］等，其表達量接近AOX1啟動子。近年來，有學(xué)者應(yīng)用雙啟動子策略可提高蛋白在畢赤酵母中的表達量。李紅亮等［14］應(yīng)用AOX1和GAP雙啟動子共表達體系，人胰島素原在畢赤酵母中的表達量最高可達到單啟動子表達量的5倍，但這些技術(shù)在肉毒蛋白表達方面還未見報道。

天然BONT的Hc片段基因中富含A－T堿基和稀有密碼子，通過降低A－T含量及同義密碼子置換人工合成Hc段基因(rHc)，以提高酵母菌表達量，是研究者采取共同的方法，外源DNA轉(zhuǎn)入畢赤酵母后，通過抗生素、營養(yǎng)缺陷載體選擇陽性重組酵母。例如，使用pHIL-D4表達載體，其包含HIS4的編碼序列以彌補GS115的缺失基因。另有研究者使用來自pPICZ家族(Invitrogen)的質(zhì)粒，依靠博來霉素(Zeocin)抗性來選擇［15－16］。

酵母可以表達外分泌型蛋白(如采用pPIC9K載體)，但經(jīng)過糖基化修飾過程，改變了重組毒素蛋白rBoNT的免疫原性，造成免疫失敗，有些研究者采用胞內(nèi)表達可溶性rBoNT方式［15－16］，但存在大批量破碎酵母細胞壁的問題。此外，與大腸桿菌相比，畢赤酵母的誘導(dǎo)表達時間較長(9～74 h)［16］。

與大腸桿菌表達系統(tǒng)的誘導(dǎo)劑IPTG相比，甲醛成本較低，在培養(yǎng)過程甲醇濃度一般0.2% ～1.1%，一般通過甲醇生物傳感器進行甲醇濃度控制，但存在響應(yīng)延遲和不穩(wěn)定的問題，也可根據(jù)溶氧變化來間接判斷甲醇(碳源)的利用情況。

關(guān)于畢赤酵母發(fā)酵蛋白的產(chǎn)量，據(jù)報道實驗室表達水平為 2.5 g rBoNT/kgWCW(濕重)，中試產(chǎn)量為 1.6 g rBoNT/kg WCW［16］和 3 g rBoNT/kgWCW［17］。由于不同研究者采取的提取工藝及純化方法存在差異，其產(chǎn)量不能直接比較，僅作參考。

3 展望

上述表達系統(tǒng)生產(chǎn)的亞單位疫苗，經(jīng)過免疫學(xué)檢測可獲得比較滿意的效果，研究表明添加佐劑如 AL(OH)3、LTB［18］、GPA［19］等或表達融合蛋白［15］均可以明顯提高亞單位疫苗的效果，但還存在以下問題:①試驗對象多以小鼠為模型動物，少數(shù)為馬、牛等大型牲畜，臨床試驗有待繼續(xù)研究。②大腸桿菌表達系統(tǒng)易產(chǎn)生內(nèi)毒素和包涵體，畢赤酵母表達的蛋白糖基化修飾過度、細胞壁裂解等問題并未徹底解決。③肉毒毒素有7個血清型，不存在交叉保護，如何研制多價疫苗。除上述2種表達系統(tǒng)外，還有其他表達方法用于試驗性研究，如桿狀病毒表達系統(tǒng)［20］、塞姆利基森林病毒復(fù)制子(SFV)載體系統(tǒng)［21］、無細胞表達系統(tǒng)［22］。雖然已經(jīng)取得一定成果，但此表達系統(tǒng)成本較高，目前還不太適合工業(yè)化生產(chǎn)需要。相信隨著科學(xué)水平的進步及各專業(yè)技術(shù)人員的共同努力，重組蛋白的表達及生產(chǎn)技術(shù)將取得更大進步。

［1］MONIKA K，MARIE S，ALI S A，et al.Efficacy of Clostridium botulinum types C and D toxoid vaccination in Danish cows［J］.Anaerobe，2013，23(10):97 －101.

［2］WEBB R P，SMITH L A.What next for botulism vaccine development?［J］.Expert Rev Vaccines，2013，12(5):481 －492.

［3］HUANG C J，LIN H，YANG X.Industrial production of recombinant therapeutics in Escherichia coli and its recent advancements［J］.J Ind Microbiol Biotechnol，2012，39(3):383 －399.

［4］GAO Y L，GAO S，KANG L，et al.Expression of Hc fragment from Clostridium botulinum neurotoxin serotype B in Escherichia coli and its use as a good immunogen［J］.Hum Vaccin，2010，6(6):462 －466.

［5］JAIN S，PONMARIAPPAN S，KUMAR O，et al.Effect of adjuvants on antibody titer of synthetic recombinant light chain of botulinum neurotoxin type B and its diagnostic potential for botulism［J］.J Microbiol Biotechnol，2011，21(7):719 －727.

［6］LEE J C，HWANG H J，SAKAGUCHI Y，et al.C terminal half fragment(50 kDa)of heavy chain components of Clostridium botulinum type C and D neurotoxins can be used as an effective vaccine［J］.Microbiol Immunol，2007，51(4):445 －455.

［7］YU Y Z，ZHANG S M，MA Y，et al.Development and evaluation of candidate vaccine and antitoxin against botulinum neurotoxin serotype F［J］.Clin Immunol，2010，137(2):271 －280.

［8］HOLLEY J L，ELMORE M，MAUCHLINE M，et al.Cloning，expression and evaluation of a recombinant sub－unit vaccine against Clostridium botulinum type F toxin［J］.Vaccine，2000，19(2/3):288 －297.

［9］YARI K，F(xiàn)ATEMI S S，TAVALLAEI M.Optimization of the BoNT/A －Hc expression in recombinant Escherichia coli using the Taguchi statistical method［J］.Biotechnol Appl Biochem，2010，56(1):35 －42.

［10］YARI K，F(xiàn)ATEMI S S，TAVALLAEI M.High level expression of recombinant BoNT/A－Hc by high cell density cultivation of Escherichia coli［J］.Bioprocess Biosyst Eng，2012，35(3):407 －414.

［11］BALDWIN M R，TEPP W H，PRZEDPELSKI A，et al.Subunit vaccine against the seven serotypes of botulism［J］.Infect Immun，2008，76(3):1314－1318.

［12］SHONE C，AGOSTINI H，CLANCY J，et al.Bivalent recombinant vaccine for botulinum neurotoxin types A and B based on a polypeptide comprising their effector and translocation domains that is protective against the predominant A and B subtypes［J］.Infect Immun，2009，77(7):2795 －2801.

［13］LIANG S，ZOU C，LIN Y，et al.Identification and characterization of P GCW14:a novel，strong constitutive promoter of Pichia pastoris［J］.Biotechnol Lett，2013，35(11):1865 －1871.

［14］李紅亮，陳勇，陳海容，等.應(yīng)用雙啟動子共表達體系提高人胰島素原在畢赤酵母中的表達量［J］.中國生物制品學(xué)雜志，2012，25(4):422－425.

［15］STAATS H F，F(xiàn)IELHAUER J R，THOMPSON A L，et al.Mucosal targeting of a BoNT/A subunit vaccine adjuvanted with a mast cell activator enhances induction of BoNT/A neutralizing antibodies in rabbits［J］.PLoS One，2011，6(1):16532.

［16］DUX M P，HUANG J，BARENT R，et al.Purification of a recombinant heavy chain fragment C vaccine candidate against botulinum serotype C neurotoxin［rBoNTC(H(c))］expressed in Pichia pastoris［J］.Protein Expr Purif，2011，75(2):177 －185.

［17］SINHA J，INAN M，F(xiàn)ANDERS S，et al.Cell bank characterization and fermentation optimization for production of recombinant heavy chain C－terminal fragment of botulinum neurotoxin serotype E(rBoNTE(H(c)):antigen E)by Pichia pastoris［J］.J Biotechnol，2007，127(3):462 －474.

［18］CUNHA C E，MOREIRA G M，SALVARANI F M，et al.Vaccination of cattle with a recombinant bivalent toxoid against botulism serotypes C and D［J］.Vaccine，2014，32(2):214 －216.

［19］STAHL C，UNGER L，MAZUET C，et al.Immune response of horses to vaccination with the recombinant Hc domain of botulinum neurotoxin types C and D［J］.Vaccine，2009，27(41):5661 －5666.

［20］VILLAFLORES O B，HSEI C M，TENG C Y，et al.Easy expression of the C－terminal heavy chain domain of botulinum neurotoxin serotype A as a vaccine candidate using a bi－ cistronic baculovirus system［J］.J Virol Methods，2013，189(1):58 －64.

［21］YU Y，YU J，LI N，et al.Individual and bivalent vaccines against botulinum neurotoxin serotypes A and B using DNA－based Semliki Forest virus vectors［J］.Vaccine，2009，27(44):6148 －6153.

［22］ZICHEL R，MIMRAN A，KEREN A，et al.Efficacy of a potential trivalent vaccine based on Hc fragments of botulinum toxins A，B，and E produced in a cell－ free expression system［J］.Clin Vaccine Immunol，2010，17(5):784－792.