孫 武，娜日蘇

(西南大學動物科技學院，重慶市牧草與草食家畜重點實驗室/重慶市草食動物資源保護與利用工程技術研究中心，重慶 400716)

轉基因豬研究新進展

孫 武，娜日蘇*

(西南大學動物科技學院，重慶市牧草與草食家畜重點實驗室/重慶市草食動物資源保護與利用工程技術研究中心，重慶 400716)

由于豬既是重要的經濟動物，又是常用的實驗動物，并且因為其解剖、組織、生理和營養(yǎng)代謝等方面與人類相似，因此轉基因豬的研究意義重大?？v觀轉基因豬的發(fā)展歷史，關鍵核心技術包括顯微注射技術、體細胞核移植技術、精子載體技術、胚胎干細胞介導技術、病毒轉染技術、基因打靶、ZFN技術和TALENS技術?？茖W家們通過這些技術對豬進行了大量研究，已經在生命科學領域取得了令人欣慰的成就。

轉基因豬；基因打靶；鋅指核酸酶；RNA干擾；轉錄激活因子效應物核酸酶

轉基因動物是指借助基因工程技術將外源目的基因導入生殖細胞、胚胎干細胞和早期胚胎，并在受體染色體上穩(wěn)定整合，能將外源目的基因傳給子代的個體，即轉基因動物(Transgenic animal)。

1 轉基因技術

1.1 顯微注射技術 顯微注射法是指將外源基因直接注射到受精卵的細胞核或細胞質中。核顯微注射法也是轉基因豬研究中最常用的技術方法。1985年Hammer等首次利用顯微注射技術將人的生長激素基因導入豬受精卵中，獲得1頭轉基因豬，與同窩非轉基因豬相比，生長速度顯著提高。Brazitikos利用此方法研究了微型豬的視網膜。Uchida利用原核顯微注射獲得了小型轉基因豬。Lee通過胞漿內顯微注射也獲得了克隆豬。2014年Ivics等利用胞漿內顯微注射技術得到了豬的轉基因胚胎[1]。顯微注射在豬的轉移率和整合效率為0.98%。由于該技術效率低，許多研究者分別從基因構件的設計、顯微注射各技術環(huán)節(jié)的改進與完善等方面進行研究，以期提高生產轉基因豬的效率。

1.2 體細胞核移植技術 體細胞核移植(Somatic cell nuclear transplantation，SCNT)技術是先將外源基因整合到供體細胞上，然后將供體細胞的細胞核移植到去核卵母細胞，組成重構胚胎，再將其移植到假孕母體，待其妊娠、分娩后便可得到轉基因的克隆豬。此方法具有相對較大的優(yōu)越性，轉基因效率較高。Prather等最早從事豬胚細胞核移植工作并獲得成功，于1989年獲得了8頭豬胚細胞核移植后代。Park等用轉染綠色熒光蛋白(EGFP)基因的成纖維細胞和耳上皮細胞作為核供體，獲得了轉基因仔豬。Lai等將著床35 d豬胎兒組織剪碎培養(yǎng)獲得纖維原細胞，用復制缺陷逆轉錄病毒作為載體，秋水仙堿處理供體核，通過核移植獲得了表達轉基因豬[2]。Nagashima等用豬的胎兒成纖維細胞作為核供體，以體外成熟的豬卵母細胞作為核受體，比較了核移植后電刺激和顯微注射對胚胎發(fā)育的影響。2004年日本靜岡縣家畜實驗場和北里大學合作成功克隆了體內含有水母基因的轉基因克隆豬。外源性促紅細胞生成素(EPO)和促紅細胞生成素衍生物(EPO-DS)對于保護視網膜至關重要。Cho等利用SCNT生產出轉人紅細胞生成素(hEPO)基因的轉基因豬。Lu等利用SCNT法得到能表達紅色熒光蛋白(RGFP)的五指山小型轉基因豬。Shimatsu等也利用SCNT方法構建α-1，3半乳糖轉移酶基因敲除的豬[3]。Li等利用SCNT生產的轉基因豬的骨髓間質細胞是器官移植很好的供體細胞[4]。Kong等通過SCNT技術將曲古抑菌素A轉移到豬的克隆胚胎中以促進端粒的延伸[5]。Bao等用含等位基因的成纖維細胞通過體細胞核轉移(SCNT)生產出了3頭GGTA1基因敲除的仔豬[6]。

1.3 胚胎干細胞介導技術及生殖干細胞 胚胎干細胞介導技術(Embryonic stem cell-mediated technology)是指將胚胎干細胞(ES)作為一種載體，將外源 DNA導人ES細胞就可以實現由此發(fā)育而成的轉基因動物。Tamm等對胚胎干細胞技術操作進行了進一步優(yōu)化，對利用胚胎干細胞介導技術生產轉基因豬起到指導性的作用[7]。該技術的優(yōu)點是外源基因的整合率很高，約50%；缺點是不易建立ES細胞系。豬的胚胎干細胞的分離比較困難，前后有多人進行了研究，但進展不大。Wheeler等用分離的胚胎干細胞生產轉基因嵌合體仔豬。中國農業(yè)科學院馮書堂等多年來也一直從事豬的胚胎干細胞研究工作，在2003年8月成功獲得了國內首例嵌合體豬。隨著科技的進步，生殖干細胞(GSC)的遺傳修飾逐步成為產生大量轉基因動物的另一個新突破口。1994年Labosky等通過胰島素樣生長因子2受體(IGF2R)基因的甲基化化印記研究了小鼠胚胎生殖細胞(EGC)系和胚胎干細胞(ESC)系區(qū)別。Zeng等借助胚胎生殖細胞(EGC)介導技術將轉基因的生殖干細胞(GSC)移植到受體睪丸里產生了供體來源的轉基因精子[8]。

1.4 病毒轉染技術 病毒介導載體法是將含有外源基因的動物病毒在感染宿主細胞后重組到宿主的基因組中，其啟動子能被宿主細胞識別，可引發(fā)導入基因的表達。病毒介導載體法包括慢病毒載體法和逆轉錄病毒載體法。Farre等嘗試通過反轉錄病毒與精子載體技術相結合的方法生產轉基因豬。Cabot等等利用攜帶EGFP蛋白基因的復制缺陷型MoM LV作為載體轉染體外成熟的豬卵母細胞后進行體外受精，獲得了表達EGFP的轉基因豬。Lai等用復制缺陷逆轉錄病毒作為載體亦獲得了表達轉基因豬。2003年Clark等利用慢病毒載體生產了1只轉基因綿豬只需5只受體母豬，而傳統(tǒng)的纖維注射法則需70只受體母豬。Kim等用慢病毒轉導法對豬睪丸細胞及基因組進行了遺傳修飾[9]。Hickey等借助嵌合體腺病毒介導的基因敲除技術獲得了高效的生產出了雜合子缺失的轉基因豬[10]。Luo等通過重組腺病毒載體獲得了基因組修飾的轉基因豬[11]。Braucher等用復制缺陷型腺病毒給豬進行鼻內接種，使豬獲得了一定的保護性免疫能力[12]。Zhang等結合慢病毒與精子載體技術成功的構建了轉基因豬[13]。2013年，Sun等利用復制缺陷重組腺病毒共表達了豬瘟病毒的Ems和E2基因，最終構建出來的轉基因豬可以免受豬瘟病毒的入侵[14]。

最近研究人員開始掀起了將轉基因配子病毒載體移植到生殖細胞的研究熱潮。Zeng等已經成功地將以腺病毒(AAV)和慢病毒(LV)為基礎的載體有效轉入豬生殖干細胞(GSC)中，并在受體公豬上產生轉基因的精子[8]。這不僅展示了腺病毒介導的轉導GSC的另一大型動物模型(豬)，而且又一次證實了前期慢病毒LV介導生產轉基因豬的可行性。

1.5 精子載體技術 精子載體技術生產轉基因動物方法簡單，只需將處理好的精子和外源DNA共同孵育后，然后通過體外受精、人工授精轉染到胚胎中，從而得到轉基因動物。最近也有研究表明透明帶(ZP)的存在加速了精子穿入胞質從而促進體外受精(IVF)的進程，結果表明在豬的體外受精過程中透明帶對于精子結合、頂體反應以及IZUMO功能的揭露甚至精卵融合都是很關鍵的因素[15]。Lavitrano成功利用精子載體法生產出轉染人衰退加速因子(hDAF)基因的仔豬，以用于器官移植的研究。Chang等利用LB-SMGT(Linker based sperm-mediated gene transfer)得到了轉基因豬和小鼠。Naruse等通過精子載體法獲得了轉人血清白蛋白(HAS)和綠色熒光蛋白(EGFP)融合的轉基因仔豬。Webster等通過精子載體法生產出同時轉綠色(EGFP)、藍色(EBFP)、和紅色(DsRed2)3種熒光的轉基因豬。

單精子卵胞漿內顯微注射(ICSI)技術是借助顯微操作系統(tǒng)將單一精子注射入卵子內使其受精,其受精生理機能與自然受精完全不同，受精的不同機制都會導致ICSI不同的結果，而精子細胞膜、核以及DNA的完整性都會影響受精率及胚胎發(fā)育率[16]。ICSI技術在豬上的應用也十分廣泛。Lai等首次報道利用ICSI方法生產轉基因豬。Yong等通過改良傳統(tǒng)的ICSI技術得到了表達EGFP的轉基因豬。Yong等通過ICSI技術比較了離心與電刺激對豬雄原核形成及卵母細胞胚胎發(fā)育的影響。Watanabe等利用ICSI方法研究了經二硫蘇糖醇(DTT)處理后的精子注射到卵母細胞后對正常受精、囊胚形成率、雄原核形成以及胚胎發(fā)育的影響，結果發(fā)現DTT處理30分鐘后可以增加正常受精和囊胚形成率及胚胎發(fā)育率。Mayuko等利用ICSI方法也得到了轉基因豬。Watanabe等利用細菌人工染色體(BAC)的構造及胞漿內單精子注射介導的基因轉移(ICSI-MGT)方法成功構建了能表達人類蛋白(膠原蛋白和白蛋白)的轉基因豬[17]。這一重大成果意義深遠，因為大多數的轉基因動物所轉入的基因大部分都是編碼序列中很小的一段區(qū)域，然而Watanabe則首次在豬上成功轉入了能夠編碼2種人類蛋白的完整基因組區(qū)域，這對今后人類的器官移植的研究非常有用。

1.6 基因敲除 基因敲除(Gene knockout)，又稱為基因打靶(Gene targeting)，是通過外源DNA與染色體DNA之間的同源重組,精細地定點修飾和改造基因DNA片段的技術。隨著生物技術的迅速發(fā)展，基因打靶技術已經成為科學家們首選的一種有力工具，該技術通常是與ZFN、RNAi、TALENS技術結合起來對豬的基因進行定向改造。Takahagi等利用基因敲除手段生產出能表達人類衰退加速因子(hDAF)和乙酰葡糖氨基轉移酶的轉基因豬。最經典的還是α-1，3-半乳糖轉移酶基因敲除豬的構建解決了人類器官移植的免疫排斥反應問題。Whyte等利用ZFN介導的基因打靶技術成功構建了表達EGFP的克隆豬。Watanabe等借助ZFN而獲得了白介素2受體基因敲除的豬[18]。

1.7 ZFN技術 隨著基因打靶技術的逐漸成熟，存在重組率非常低的問題，因此鋅指核酸酶(Zinc-finger nuclease,ZFN)技術在一定程度上克服了此問題。重組鋅指核酸酶是鋅指蛋白和FokI核酸內切酶的剪切結構域組成的嵌合融合蛋白,其鋅指蛋白結構域負責識別靶位點,依賴FokI的作用打斷DNA雙鏈,從而造成雙鏈斷裂。在ZFN技術方面做出開創(chuàng)性工作的是Desjarlais等在序列分析的基礎上,通過天然鋅指的組合與匹配,得到能識別特異DNA位點的全新鋅指蛋白。Hauschild等利用ZFN技術構建了雙等位基因敲除克隆豬。Yang等結合ZFN和核移植技術成功克隆了PPAR基因敲除的轉基因豬。Whyte等利用ZFN介導的基因打靶技術構建了EGFP敲除的轉基因豬。轉基因豬是人類疾病和器官移植捐贈的寶貴模型。GGTA1基因產生的半乳糖表位是引發(fā)超急性免疫排斥反應的主要因素。Bao等使用ZFN敲除了豬α-1，3-半乳糖轉移酶(GGTA1)基因，并且用含等位基因的成纖維細胞通過體細胞核轉移(SCNT)生產出了3頭GGTA1基因敲除的仔豬，并且基因敲除的原代成纖維細胞系也由此而在豬上建立起來。在功能上，GGTA1基因敲除的細胞與人血清培養(yǎng)時免受補體介導的免疫攻擊的能力大大增強，GGTA1敲除的豬和GGTA1敲除的胎兒成纖維細胞將有利于研究豬-人器官移植[6]。從ZFN的發(fā)展歷史來看，鋅指核酸酶技術發(fā)展的越越來快，將使動物的創(chuàng)建速度更快,對于研究轉基因豬具有重要意義。

1.8 RNAi技術 RNA干涉(RNA interference，RNAi)是指雙鏈RNA在細胞內特異性誘導與之同源互補的mRNA降解，使相應基因的表達關閉，從而引發(fā)基因轉錄后水平沉默的現象。1998年Andrew Fire等首次證實雙鏈RNA分子可誘導同源目標mRNA降解，導致特定基因表達沉默，并將其命名為RNA干擾，在維持基因組穩(wěn)定、基因表達調控等方面發(fā)揮重要生物學作用。2000年Wianny等分別證實在小鼠胚胎細胞和卵母細胞中dsRNA能引發(fā)RNAi效應。Elbashir等在《Nature》上首次證實哺乳動物細胞中存在RNAi機制。2002年Ding SW等首次證明動物細胞利用RNA沉默來抵御病毒侵染。Merkl等進行豬RNA干擾和表達載體介導基因打靶的比較試驗，完善了RNA干擾技術在轉基因豬制備中的應用[19]。針對豬體內存在的內源性逆轉錄病毒(Endogenous retrovirus,ERV)可能會通過移植傳染給人的危險。Semaan等嘗試利用RNAi技術來抑制豬內源逆轉錄病毒(PERV)在內皮細胞的表達[20]。Han等用shRNA轉染豬血管內皮細胞，并檢測了細胞增殖、凋亡、補體C3激活以及人類免疫球蛋白和補體系統(tǒng)(包括IgM、IgG、C3、及C5b-9等成分)，結果發(fā)現經過RNA干擾后轉染的細胞增殖率明顯高于未轉染細胞，且細胞凋亡率降低?？傊?，RNA干擾降低了豬血管內皮細胞中免疫球蛋白和補體系統(tǒng)與細胞的反應[21]。豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來重大損失。許多研究表明，腺病毒介導的RNA干擾技術可能抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)在體內和體外的復制。Li等應用RNAi技術進行轉基因(TG)豬與非轉基因(NTG)豬及野生型豬的對比試驗，發(fā)現RNA干擾試驗顯著降低了血清中HP-PRRSV滴度，并且TG豬的存活時間比NTG對照組增加了3 d[22]。隨著人們對RNAi研究的不斷深入,發(fā)現RNAi具有高穩(wěn)定性、高效性、高特異性、高穿透性等特點特別適合于轉基因動物的研究。

1.9 TALENS技術 大鼠被認為是研究基因功能和人類疾病的首選模式動物，近年來工程技術已經被應用到修飾編輯不同物種的基因組中?；虼虬屑夹g的發(fā)展對于創(chuàng)造人類疾病新大鼠動物模型及基因功能、蛋白表達分析至關重要。由此轉錄激活因子樣效應物核酸酶(TALEN)介導的基因打靶技術應運而生，該轉錄效應核酸酶(TALEN)可以融合進入DNA結構域從而靶作用于靶基因，TALEN技術是一項創(chuàng)建新鼠動物模型的高效、成本低的方法[23-24]。Beumer對果蠅ZFN與TALEN基因打靶技術的比較，結果發(fā)現TALEN介導的打靶技術成功率顯著高于ZFN技術[25]。2013年Sung等利用TALEN介導的基因打靶技術創(chuàng)建基因敲除小鼠的報道也為數不少。乙型肝炎病毒(HBV)是一種DNA病毒可以引起人類慢性乙型肝炎，而科學家們利用TALENS技術對該病毒的基因組進行靶作用，有效抑制了乙型肝炎病毒的復制，為患有乙型肝炎的患者帶來了曙光[26-27]。TALENS技術發(fā)展迅速，預計在豬上的應用中將會得到充分應用，這對于養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展及解決器官移植問題都有重要意義。

2 展望

轉基因豬的研究和應用將是21世紀生物工程技術領域最活躍、最具有應用價值的研究課題之一，將給人類的醫(yī)藥衛(wèi)生、生物材料和家畜改良等領域帶來革命性的變化，充分利用顯微注射、精子介導、ZFN和TALEN介導的基因打靶技術來構建轉基因豬將是今后生物科學領域的熱點之一，尤其TALEN技術目前僅僅是在小鼠等動物上使用，在豬方面相關的報道還很少，但相信在不久的將來TALEN介導的基因打靶構建的轉基因豬將成為科學家的熱議話題。利用各種轉基因技術對豬的基因組進行合理修飾和編輯對于挖掘和合理開發(fā)及保護當地豬品種資源提供了科學依據，這對于遺傳學研究和遺傳育種將起到巨大的推動作用。

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Research Progress in Transgenic Pigs

SUN Wu, NA Ri-su

(Chongqing Key Laboratory of Forage and Herbivore/Chongqing Engineering Research Center for Herbivores Resource Protection and Utilization, College of Animal Science and Technology of Southwest University, Chongqing 400716)

Porcine is an important economic animals in livestock, and is commonly used as experimental animals model. The characteristic of pigs in anatomy, tissue physiology and nutrition metabolism is similar with human, therefore, the research about transgenic pigs is significant. Throughout the history of gene transfer in pigs, the key core technologies include:microinjection, somatic cell nuclear transfer, sperm vector, embryonic stem cell-mediated, viral transfection, gene targeting, ZFN technology, TALENS technology. By studying these techniques scientists have done has made a lot gratifying achievements in pigs, in life sciences today.

Transgenic pigs; Gene targeting; ZFN; RNAi; TALENS

中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項(XDJK2010C101)；西南大學博士基金項目(SWU111048)；國家自然科學基金面上項目(31172195)。

孫武(1986- )，男，甘肅高臺人，碩士研究生，研究方向：動物遺傳育種與繁殖。*通訊作者，副研究員，博士，從事動物遺傳育種學研究。

2014-04-28

S 828

A

0517-6611(2014)15-04650-03