陳卓玥 蔡玉龍 張成 蔡虎 陜西省醫(yī)療器械檢測(cè)中心 （西安 710075）

石英晶體微天平技術(shù)的發(fā)展始于上世紀(jì)60年代初期，1959 年Sauerbrey 發(fā)表論文[1]指出石英諧振器頻率的移動(dòng)與增加的質(zhì)量成正比例，此發(fā)現(xiàn)被看作是一個(gè)突破，邁出了利用一種新的定量方法來(lái)測(cè)量微量物質(zhì)的第一步，進(jìn)而提出了石英微天平。QCM-D 現(xiàn)已成為實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)的質(zhì)量感測(cè)設(shè)備，其靈敏度為0.001mg，比靈敏度是0.1mg 的電子微天平高100 倍，理論上可以測(cè)到質(zhì)量變化相當(dāng)于單分子層或單個(gè)原子層的幾分之一。QCM-D 所具有的高靈敏度以及在石英晶體上可實(shí)時(shí)測(cè)量質(zhì)量變化的特點(diǎn)，使它在很多領(lǐng)域的應(yīng)用上成為一種極具吸引力的技術(shù)。1997 年Michael Rodahl 等人[2]應(yīng)用QCM-D 檢測(cè)生物分子的吸附量和細(xì)胞的粘附情況。2005 年Hianik 等人[3]將QCM 技術(shù)應(yīng)用于DNA 適配子和凝血酶復(fù)合物的檢測(cè)研究，獲得了精確的數(shù)據(jù)。近年來(lái)有大量的研究報(bào)道，QCM 技術(shù)應(yīng)用于人血清白蛋白吸附研究[4]，材料表面結(jié)合CD34 抗體的研究[5]，以及定量乳清蛋白吸附的研究[6]均取得了突破性研究進(jìn)展。采用QCM 技術(shù)可獲得高精度的數(shù)據(jù)，使其成為定量檢測(cè)蛋白質(zhì)在材料表面吸附研究的熱點(diǎn)。

1. QCM 主要結(jié)構(gòu)和作用

圖1. 石英晶片盒以及用專用鑷子夾起的石英晶片

圖2. (A)整套QCM 檢測(cè)設(shè)備；(B)四個(gè)檢測(cè)模塊

圖3. QCM 實(shí)驗(yàn)裝置示意圖

QCM 的主要組成有三個(gè)部分：石英晶體傳感器、信號(hào)檢測(cè)和數(shù)據(jù)處理器。石英晶體振蕩片是從一塊石英晶體上沿著與石英晶體主光軸成+35?15?切割(AT—cut)得到，在它的兩個(gè)對(duì)應(yīng)面上涂敷金膜作為金電極，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。在每個(gè)電極上各焊一根引線接到管腳上，再加上封裝外殼就構(gòu)成了石英晶體諧振器，其產(chǎn)品一般用金屬外殼封裝，也有用玻璃殼、陶瓷或塑料封裝的。石英晶體微天平的其他組成結(jié)構(gòu)在不同型號(hào)和規(guī)格的儀器中也不盡相同，可根據(jù)測(cè)量需要選用或聯(lián)用。一般附屬結(jié)構(gòu)還包括振蕩線路、頻率計(jì)數(shù)器、計(jì)算機(jī)系統(tǒng)等；電化學(xué)石英晶體微天平在此基礎(chǔ)上還包括恒電位儀、電化學(xué)池、輔助電極、參比電極等；另外經(jīng)常加裝一些輔助輸出設(shè)備，例如顯示器、打印機(jī)等。QCM 試驗(yàn)裝置實(shí)體圖及示意圖分別見(jiàn)圖2 和圖3。

2. QCM 檢測(cè)原理

QCM 作為一種感應(yīng)表面質(zhì)量變化的傳感器，在蛋白質(zhì)吸附的研究方面，已經(jīng)發(fā)揮了重要的作用。壓電石英晶體生物傳感器主要由用生物識(shí)別物質(zhì)包被的壓電石英晶體、振蕩器和頻率計(jì)數(shù)器等組成[7]。

壓電石英晶體諧振測(cè)量技術(shù)是應(yīng)用壓電效應(yīng)進(jìn)行測(cè)量的。石英晶體在交變激勵(lì)電壓施加于兩側(cè)的電極時(shí)，會(huì)產(chǎn)生機(jī)械振蕩。當(dāng)交變激勵(lì)電壓的頻率與石英晶體的固有頻率相同時(shí)，振幅變得比一般情況下大得多，形成壓電諧振。一定質(zhì)量的物質(zhì)沉積在石英晶體表面，其振蕩頻率就會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化。石英晶體諧振頻率和晶體電極表面質(zhì)量負(fù)載變化之間的關(guān)系可由Sauerbrey 方程[1]表示：

ΔF = -KF2ΔM/A

公式中 ΔF—晶體吸附外來(lái)物質(zhì)后振動(dòng)頻率的

變化，單位Hz；

K—常數(shù)；A—為被吸附物所覆蓋的

面積，單位m2；

F—壓電晶體的基本頻率，單位MHz；

ΔM—被吸附物質(zhì)的質(zhì)量，單位g 。

由方程可知，ΔF 與ΔM 呈線性關(guān)系。此公式僅適用于氣相反應(yīng)環(huán)境，在液相環(huán)境中粘度、密度、電導(dǎo)率和溶液極性等影響ΔF 與ΔM 的量值關(guān)系。1985 年，Bruckenstein 與Kanazawa 等人先后建立了Voigt 黏彈性模型：

Δf = f3/2 (ρη/πρqηq ) 1/2

ρ：溶液的密度；η：溶液的粘度；ρq：純水的密度；ηq：純水的粘度

除鹽溶液和高聚合物溶液外，在其他溶液中晶片的頻率變化Δf 與溶液的(ρη) 1/2 是呈線性變化的[8]，使QCM 得以應(yīng)用于液相反應(yīng)環(huán)境中。

化學(xué)池里的外來(lái)物質(zhì)均勻地附著于電極表面上，引起電極震動(dòng)頻率的變化，附著物質(zhì)的質(zhì)量變化引起震動(dòng)頻率相關(guān)的變化，從而可以測(cè)量到納克級(jí)別的質(zhì)量變化[9]。同時(shí)電極表面的能量變化可以表示出附著電極表面的物質(zhì)的粘度變化。

3. QCM 檢測(cè)方法

3.1 清洗石英晶片

從晶片盒中用專用鑷子取出石英晶片，放入專門用來(lái)清洗石英晶片的托子上。用吸管吸取配好的溶液（溶液體積配比為氨水:雙氧水:雙蒸水= 5:1:1）到小燒杯中，吸取溶液的體積到可以浸沒(méi)過(guò)托子上晶片的程度，將裝了清洗液的小燒杯口用錫箔紙封住，放入75?C 水浴箱中加熱到75?C±2?C。取出小燒杯，將放了晶片的托子放入小燒杯，再放入75?C±2?C 水浴箱中保持15 分鐘。取出托子，用雙蒸水清洗晶片，清洗后自然風(fēng)干，將石英晶片放入晶片盒中。

3.2 電極預(yù)處理

首先配制預(yù)處理溶液，用錫箔紙罩住培養(yǎng)皿口，放到恒溫磁力攪拌器上，溫度調(diào)節(jié)為80?C±2?C。待溶液溫度控制到80?C±2?C 后，用專業(yè)鑷子夾取金片放入配好溶液的培養(yǎng)皿中，約10 分鐘，取出金片，將金片放入盛有雙蒸水的培養(yǎng)皿中清洗。

3.3 測(cè)定蛋白質(zhì)吸附情況

將預(yù)制濃度的蛋白質(zhì)溶液以固定流速（通常為50μl/min）通入檢測(cè)模塊，設(shè)定通過(guò)模塊的溶液溫度（常用溫度為37?C），直到QCM 曲線穩(wěn)定，輔助輸出設(shè)備會(huì)隨時(shí)間變化跟蹤記錄石英晶片震動(dòng)頻率以及能量的變化，對(duì)應(yīng)為石英晶片表面吸附蛋白質(zhì)質(zhì)量和粘度變化。

3.4 清洗檢測(cè)模塊及石英晶片

3.4.1 清洗檢測(cè)模塊步驟如下：

（1）用PBS 沖洗，流速適當(dāng)調(diào)大，沖洗3 到5 分鐘；

（2）用SDS 沖洗；

（3）用雙蒸水沖洗；

（4）抽空；

（5）打開(kāi)模塊，兩面用吹風(fēng)機(jī)吹干。3.4.2 清洗石英晶片步驟如下：

（1）將氨水水浴加熱到75?C±2?C，晶片放在托子上，放入氨水中浸泡15 分鐘；

（2）SDS 水浴加熱到70?C±2?C，將放有晶片的托子放入，維持15 分鐘；

（3）雙蒸水加熱到70?C±2?C，將晶片放入，浸泡15 分鐘；

（4）取出晶片，自然風(fēng)干后，放入石英晶片盒中。

4. QCM 技術(shù)在蛋白質(zhì)吸附領(lǐng)域的應(yīng)用

Shons 等人于1972 年首次報(bào)道將BSA 固定 于壓電晶體表面用于檢測(cè)BSA 抗體。目前QCM 技術(shù)已應(yīng)用于免疫球蛋白、白蛋白、纖維蛋白(原)及降解產(chǎn)物、補(bǔ)體、酶蛋白、甲狀腺素、人絨毛膜促性腺激素及皮質(zhì)醇等檢測(cè)[9]。測(cè)定抗原/抗體等生物樣品所使用的免疫傳感器可分為無(wú)標(biāo)記（直接測(cè)定）型和標(biāo)記（間接測(cè)定）型兩種類型[10]。王珂等人[8]提出，無(wú)標(biāo)記型免疫傳感器通過(guò)直接測(cè)定抗原抗體復(fù)合物形成時(shí)的物理、化學(xué)變化，極大地簡(jiǎn)化制備和操作過(guò)程。石英晶體微天平作為無(wú)標(biāo)記型免疫傳感器中的一種，近年來(lái)成為應(yīng)用于抗原/抗體檢測(cè)研發(fā)的熱點(diǎn)。QCM 技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)吸附研究具有以下優(yōu)點(diǎn)：

（1）生物樣品無(wú)需標(biāo)記；

（2）能夠?qū)崟r(shí)記錄蛋白質(zhì)在材料表面的吸附行為；

（3）傳感器表面可清洗重復(fù)利用；

（4）可在短時(shí)間內(nèi)完成蛋白質(zhì)吸附檢測(cè)，具有高效性。

近年來(lái)，由于臨床診斷、環(huán)境保護(hù)、食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域發(fā)展的實(shí)際需求，在分析過(guò)程中越來(lái)越多地需要對(duì)被分析物進(jìn)行快速、在線、痕量的分析和監(jiān)測(cè)，相信隨著QCM 技術(shù)的快速發(fā)展和應(yīng)用的日趨成熟，其將會(huì)更廣泛地應(yīng)用于微量檢測(cè)研究領(lǐng)域。

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