周遠(yuǎn)明，劉 帥，鄭國生，馬傳利，史美麗

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島266109）

牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）為芍藥屬木本植物，其根皮即牡丹皮是一種重要的中藥材，俗稱“丹皮”，藥效顯著，研究較多［1－9］。我國民間有將牡丹雄蕊制成雄蕊茶飲用的習(xí)慣，因其具有降糖、降血脂和降血壓等效果，也逐漸引起了人們的關(guān)注。

多糖是牡丹中重要的化學(xué)成分之一，在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)、降血糖、抗衰老等方面有較強(qiáng)活性［10］。目前尚未見牡丹雄蕊多糖的研究報(bào)道。作者在此采用熱水法從牡丹雄蕊中提取多糖，并對(duì)提取工藝進(jìn)行研究，以期為開發(fā)利用牡丹雄蕊多糖提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

牡丹雄蕊，采集于青島農(nóng)業(yè)大學(xué)牡丹園，經(jīng)青島農(nóng)業(yè)大學(xué)鄭國生教授鑒定品種為“鳳丹”。

石油醚、乙醇、濃硫酸、葡萄糖、丙酮、苯酚、乙醚等試劑均為分析純。

微型植物粉碎機(jī)，天津泰斯特；超低溫冰箱，日本SANYO；電子天平，德國Sartorius；恒溫水浴鍋，上海森信；超聲細(xì)胞破碎儀，德國Hielscher；RE－52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮；循環(huán)水式真空泵，浙江黃巖求精真空泵廠；U－2900型紫外可見分光光度計(jì)，日本HITACHI；高速離心機(jī)，Eppendorf。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制［11］

準(zhǔn)確移取0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60 mL、0.80mL、1.00mL、1.20mL、1.40mL、1.60mL的0.04mg·mL－1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別置于10 mL試管中，加入適量蒸餾水至2.0mL，各加5%苯酚溶液1.0mL，振蕩搖勻后滴加濃硫酸5.0mL，靜置10min，搖勻，室溫放置20min，于波長(zhǎng)490nm處測(cè)定吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)、葡萄糖濃度c（μg· mL－1）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得回歸方程：A＝0.0139c－0.0117（R2＝0.9983）。

1.3 牡丹雄蕊多糖的提取

1.3.1 工藝流程

牡丹雄蕊→陰干、粉碎→超聲－凍融法破壁→石油醚脫脂→80%乙醇除還原糖和寡糖→熱水提取→濃縮→95%乙醇沉淀→4 800r·min－1離心→沉淀冷凍干燥→粗多糖。

1.3.2 提取方法

1）牡丹雄蕊破壁：收集未散粉的牡丹雄蕊200g，陰干，粉碎，過40目篩。向牡丹雄蕊中加入10BV的蒸餾水，攪拌，置于超低溫（－80℃）冰箱中冷凍12h。然后投入80℃水浴鍋中水浴1h，解凍；再經(jīng)200W超聲處理20min。以上過程再重復(fù)2次，真空干燥，粉碎，得破壁牡丹雄蕊。

2）牡丹雄蕊脫脂：取破壁牡丹雄蕊，加600mL石油醚于60℃回流提取6h，重復(fù)1次，抽濾，所得固體為脫脂破壁牡丹雄蕊。

3）牡丹雄蕊除還原糖、寡糖：向脫脂破壁牡丹雄蕊中加入80%乙醇600mL，于85℃回流提取6h，重復(fù)1次，抽濾，所得固體真空干燥，得到除還原糖、寡糖和脫脂的破壁牡丹雄蕊（即處理后雄蕊）。

4）牡丹雄蕊多糖的提?。喝√幚砗笮廴?.0g，加15mL蒸餾水于90℃提取2h，提取2次；合并提取液，過濾，濾液減壓濃縮；濃縮液加入3BV的95%乙醇，過夜沉淀；于4 800r·min－1離心10min，棄上清液，沉淀冷凍干燥，即得牡丹雄蕊粗多糖。

1.4 牡丹雄蕊多糖提取率的測(cè)定

取牡丹雄蕊粗多糖溶于100mL蒸餾水中，取2.50mL溶液至25mL容量瓶中，定容。取1.0mL上述溶液置于10mL試管中，按1.2方法測(cè)定吸光度，由回歸方程求得多糖質(zhì)量。多糖提取率按下式計(jì)算：

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 提取溫度對(duì)牡丹雄蕊多糖提取率的影響（圖1）

圖1 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響Fig.1 The effect of extraction temperature on extraction rate of polysaccharides

由圖1可知，牡丹雄蕊多糖的提取率隨提取溫度的升高而增大。由于多糖是活性物質(zhì)，提取溫度過高可能破壞其結(jié)構(gòu)，影響其生物活性；且提取溫度越高，能耗越大。因此，初步選擇提取溫度為90℃。

2.1.2 料液比對(duì)牡丹雄蕊多糖提取率的影響（圖2）

由圖2可知，隨著熱水用量的增加，牡丹雄蕊多糖的提取率先增大后減?。划?dāng)料液比（g∶mL，下同）為1∶20時(shí)達(dá)到最大值，考慮到熱水用量過多會(huì)使提取液濃縮的能耗增大、時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)多糖結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不利影響，而料液比為1∶15時(shí)多糖提取率已經(jīng)較高，因此，初步選擇料液比為1∶15。

圖2 料液比對(duì)多糖提取率的影響Fig.2 The effect of solid－liquid ratio on extraction rate of polysaccharides

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)牡丹雄蕊多糖提取率的影響（圖3）

圖3 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig.3 The effect of extraction time on extraction rate of polysaccharides

由圖3可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖提取率不斷增大：提取1～2h時(shí)提取率增加迅速，之后增幅趨緩，3h后多糖提取率增加不明顯。考慮到提取時(shí)間過長(zhǎng)可能會(huì)破壞多糖的結(jié)構(gòu)，同時(shí)效率降低、能耗增大，因此，初步選擇提取時(shí)間為3h。

2.1.4 提取次數(shù)對(duì)牡丹雄蕊多糖提取率的影響（圖4）

圖4 提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響Fig.4 The effect of extraction times on extraction rate of polysaccharides

由圖4可知，提取次數(shù)增加，牡丹雄蕊多糖提取率增大；但提取3次之后，牡丹雄蕊多糖提取率增加緩慢，表明多糖已基本浸出。由于提取次數(shù)的增加會(huì)使后續(xù)的濃縮能耗增大而增加成本，因此，初步選擇提取3次。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以提取溫度（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C）、提取次數(shù)（D）為考察因素，以牡丹雄蕊多糖提取率為考察指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)以優(yōu)化提取工藝條件，正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與分析見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析Tab.1 The results and analysis of orthogonal experiment

由表1可知，各因素對(duì)牡丹雄蕊多糖提取率的影響大小依次為：提取溫度＞提取次數(shù)＞提取時(shí)間＞料液比，最佳提取工藝為A3B2C3D2，即提取溫度90℃、料液比1∶15、提取時(shí)間3h、提取3次。

在最佳提取工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，牡丹雄蕊多糖提取率為3.06%，高于正交實(shí)驗(yàn)的最高提取率，表明所確定優(yōu)化工藝條件有效。

3 結(jié)論

采用熱水法浸提牡丹雄蕊多糖，通過正交實(shí)驗(yàn)確定最佳提取條件為：提取溫度90℃、料液比1∶15（g∶mL）、提取時(shí)間3h、提取3次，在此條件下，牡丹雄蕊多糖提取率為3.06%。

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