段向東，賈嘯靜，陳麗華，仲偉潭，段寶玲

（華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司 微生物藥物國家工程研究中心河北省微生物代謝工程技術(shù)研究中心，河北石家莊050015）

達(dá)托霉素（daptomycin）是玫瑰孢鏈霉菌（Streptomyces roseosporus）發(fā)酵產(chǎn)物脂肽類化合物A21978C的N－癸?；苌铮黔h(huán)酯肽類新抗生素家族的第1個(gè)產(chǎn)品。1987年Lilly公司首先發(fā)現(xiàn)達(dá)托霉素具有良好的抗菌活性，1997年Cubist公司獲得該藥的開發(fā)權(quán)，2003年美國食品與藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)注射用達(dá)托霉素上市。

達(dá)托霉素具有獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)，含有13個(gè)氨基酸，其中10個(gè)氨基酸形成環(huán)十脂肽，另外3個(gè)氨基酸肽鏈N－末端的色氨酸與1個(gè)癸酸側(cè)鏈相連［1］。達(dá)托霉素的作用機(jī)制不同于其它抗生素，既可以擾亂細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸，使細(xì)菌無法合成細(xì)胞壁的主要成分肽聚糖［2］，也可以破壞細(xì)胞膜從而殺死細(xì)菌［3］。達(dá)托霉素能殺死絕大多數(shù)的革蘭氏陽性菌，特別是對耐藥菌如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、耐萬古霉素腸球菌等有很強(qiáng)的活性［4］，被認(rèn)為是“病原菌最后一道防線——萬古霉素”的最佳替代品。

原生質(zhì)體由于去除了外壁障礙，因而對各種誘變劑敏感性較強(qiáng)，往往正突變率高［5］，近年來原生質(zhì)體誘變育種技術(shù)被廣泛應(yīng)用。王曉蕾等［6］通過紫外誘變筑波鏈霉菌原生質(zhì)體，篩選得到1株高產(chǎn)菌株，與出發(fā)菌株相比，該菌株的他克莫司平均發(fā)酵單位提高51.4%。朱林東等［7］通過紫外誘變始旋鏈霉菌11－2原生質(zhì)體，獲得高產(chǎn)突變株ZP－07，普那霉素產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高101.3%。而目前原生質(zhì)體誘變選育達(dá)托霉素高產(chǎn)菌株尚未見報(bào)道。作者研究了達(dá)托霉素產(chǎn)生菌玫瑰孢鏈霉菌D－30原生質(zhì)體制備及再生的最適條件，并采用紫外誘變方法處理制備的原生質(zhì)體，以期篩選得到達(dá)托霉素的高產(chǎn)菌株。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種

玫瑰孢鏈霉菌（Streptomyces roseosporus）D－30，華北制藥集團(tuán)研發(fā)中心保存。

1.2 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基（g·L－1）：葡萄糖20，酵母粉20，MgSO4·7H2O 1.5，K2HPO41，NaCl 0.5，瓊脂15，pH值7.5。

種子培養(yǎng)基（g·L－1）：葡萄糖5，糊精15，蛋白胨10，酵母粉10，MgSO4·7H2O 0.3，K2HPO40.2，甘氨酸適量，pH值7.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g·L－1）：葡萄糖7，可溶性淀粉15，酵母粉5，蛋白胨15，K2SO48，L－天冬氨酸0.5，pH值7.0。

微量元素、TES緩沖溶液、P液、再生培養(yǎng)基的配制參照《工業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊》［8］。

1.3 原生質(zhì)體的制備

在含有甘氨酸的種子培養(yǎng)基中接種新鮮玫瑰孢鏈霉菌D－30的斜面孢子，搖瓶培養(yǎng)溫度28℃、搖床轉(zhuǎn)速220r·min－1，培養(yǎng)一段時(shí)間后以3 000r·min－1離心收集菌絲體，用含有玻璃珠的三角瓶打碎、用P液以3 000r·min－1離心洗滌3次，加入一定濃度的溶菌酶溶液，渦旋混勻，在水浴溫度32℃下進(jìn)行酶解，每隔5min搖晃1次，當(dāng)原生質(zhì)體形成數(shù)量較多時(shí)停止，先以600r·min－1低速離心10min，取上清，去除混合液中的細(xì)胞壁和菌絲片斷，再用P液以3 000r· min－1離心洗滌3次，將得到的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)移到P液中備用。

1.4 原生質(zhì)體的再生

將分離培養(yǎng)基和再生培養(yǎng)基滅菌后倒入無菌平皿中，待培養(yǎng)基凝固后打開平皿蓋，在超凈臺上風(fēng)干表面的水分。用酶解前的菌絲體涂布含有分離培養(yǎng)基的平板；用P液將原生質(zhì)體稀釋到一定濃度后涂布含有再生培養(yǎng)基的平板、用無菌水將原生質(zhì)體稀釋到一定濃度后涂布含有再生培養(yǎng)基的平板，將3種平板28℃恒溫培養(yǎng)9d。

1.5 原生質(zhì)體的制備率、再生率計(jì)算

原生質(zhì)體的制備率、再生率按下列公式計(jì)算：

式中：A為用酶解前的菌絲體涂布分離培養(yǎng)基平板長出的菌落數(shù)；B為用P液將原生質(zhì)體稀釋到一定濃度后涂布再生培養(yǎng)基平板存活的菌落數(shù)；C為用無菌水將原生質(zhì)體稀釋到一定濃度后涂布再生培養(yǎng)基平板存活的菌落數(shù)。

1.6 原生質(zhì)體紫外誘變

用P液將原生質(zhì)體稀釋到適當(dāng)濃度后用吸管將其轉(zhuǎn)到無菌平皿中，每皿100μL，輕輕晃動待其混勻后放置在30W紫外燈下32cm處，進(jìn)行不同照射時(shí)間誘變處理：0s、10s、20s、30s、40s、50s、60s、70s；照射后于暗處靜置30min，收集誘變后的原生質(zhì)體，將其稀釋到一定濃度后涂布在含有再生培養(yǎng)基的平板上。

1.7 發(fā)酵培養(yǎng)

挑選再生培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)成熟的單菌落接種至空白斜面，于28℃恒溫培養(yǎng)9d，待培養(yǎng)好后接種于種子培養(yǎng)基，搖瓶溫度28℃、搖床轉(zhuǎn)速220r·min－1，培養(yǎng)30h。吸取0.5mL培養(yǎng)好的種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，搖瓶溫度28℃、搖床轉(zhuǎn)速220r·min－1，培養(yǎng)120～144h后取發(fā)酵液測效價(jià)。

1.8 分析方法

采用HPLC法測定發(fā)酵液中達(dá)托霉素的產(chǎn)量。液相色譜條件：反向C18色譜柱；流動相為含0.1%三氟乙酸的乙腈－水（46∶54，體積比）；流速1mL· min－1；檢測波長220nm；柱溫32℃；進(jìn)樣量15μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 種齡對原生質(zhì)體形成的影響

不同種齡的菌絲經(jīng)過處理后都可以制成原生質(zhì)體，但原生質(zhì)體制備率差異較大。一般對數(shù)生長期的菌絲利于原生質(zhì)體的制備，原生質(zhì)體的再生效果也比較好。分別采用種齡為24h、30h、36h、42h的菌絲制備原生質(zhì)體，考察種齡對原生質(zhì)體形成的影響，結(jié)果見表1。

表1 種齡對原生質(zhì)體形成的影響Tab.1 Effect of seed age on protoplast formation

由表1可知，種齡為30h的菌絲原生質(zhì)體釋放量最大，此時(shí)菌絲處于對數(shù)生長期，菌體活力旺盛，利于原生質(zhì)體的形成，制備的原生質(zhì)體活性更強(qiáng)。因此，種齡為30h的菌絲宜于達(dá)托霉素產(chǎn)生菌原生質(zhì)體的制備。

2.2 甘氨酸添加量對菌絲濃度及原生質(zhì)體制備率的影響

考察甘氨酸添加量對菌絲濃度及原生質(zhì)體制備率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 甘氨酸添加量對菌絲濃度及原生質(zhì)體制備率的影響Fig.1 Effects of glycine addition amount on cell concentration and protoplast preparation rate

鏈霉菌細(xì)胞壁的主要成分肽聚糖主要通過丙氨酸交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。如果在培養(yǎng)鏈霉菌種子時(shí)加入甘氨酸，它的分子結(jié)構(gòu)與丙氨酸類似，可以干擾細(xì)胞壁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的合成，利于瓦解細(xì)胞壁釋放原生質(zhì)體，但是加入過量的甘氨酸會影響菌體正常生長，不利于原生質(zhì)體制備。由圖1可知，隨著甘氨酸添加量的增加，菌絲濃度不斷降低；當(dāng)甘氨酸添加量低于0.6%時(shí)，原生質(zhì)體制備率逐漸上升，高于0.6%時(shí)原生質(zhì)體制備率反而下降。綜合考慮，制備原生質(zhì)體時(shí)在種子培養(yǎng)基中加入0.6%的甘氨酸為宜。

2.3 溶菌酶濃度對原生質(zhì)體制備及再生的影響

溶菌酶能將鏈霉菌細(xì)胞壁的主要成分肽聚糖水解形成原生質(zhì)體，是鏈霉菌原生質(zhì)體制備的一個(gè)重要影響因素。將菌絲體培養(yǎng)30h后，分別以不同濃度（1 mg·mL－1、2mg·mL－1、3mg·mL－1、4mg· mL－1）的溶菌酶于32℃酶解60min，測定原生質(zhì)體的濃度和再生率，結(jié)果如圖2所示。

圖2 溶菌酶濃度對原生質(zhì)體濃度和再生率的影響Fig.2 Effects of lysozyme concentration on density and regeneration rate of protoplast

由圖2可知，隨著溶菌酶濃度的上升，原生質(zhì)體的濃度也相應(yīng)升高，再生率卻逐漸降低。這可能是因?yàn)椋好笣舛冗^低時(shí)細(xì)胞壁不能充分酶解，原生質(zhì)體濃度較低；而酶濃度過高則降低了原生質(zhì)體的活性，從而降低了原生質(zhì)體的再生率。綜合考慮，溶菌酶的濃度以2mg·mL－1為宜。

2.4 酶解時(shí)間對原生質(zhì)體制備及再生的影響

將菌絲體培養(yǎng)30h后，在32℃下以2mg·mL－1的溶菌酶酶解不同時(shí)間，測定原生質(zhì)體的濃度和再生率，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，隨著酶解時(shí)間的延長，原生質(zhì)體的濃度相應(yīng)升高，但再生率卻逐漸降低。這可能是因?yàn)椋好附鈺r(shí)間過長時(shí)細(xì)胞壁去除程度過深，導(dǎo)致合成細(xì)胞壁的引物丟失，進(jìn)而影響了原生質(zhì)體的再生。綜合考慮，酶解時(shí)間以75min為宜。

圖3 酶解時(shí)間對原生質(zhì)體濃度和再生率的影響Fig.3 Effects of enzymolysis time on density and regeneration rate of protoplast

2.5 酶解溫度對原生質(zhì)體制備及再生的影響

將菌絲體培養(yǎng)30h后，分別以2mg·mL－1的溶菌酶在不同酶解溫度（28℃、30℃、32℃、34℃、36℃）下酶解75min，測定原生質(zhì)體的濃度和再生率，結(jié)果如圖4所示。

圖4 酶解溫度對原生質(zhì)體濃度和再生率的影響Fig.4 Effects of enzymolysis temperature on density and regeneration rate of protoplast

由圖4可知，隨著酶解溫度的上升，原生質(zhì)體的濃度和再生率先升高后降低，均在酶解溫度為32℃時(shí)達(dá)到最高值。這可能是因?yàn)椋好附鉁囟鹊陀?2℃時(shí)，溶菌酶活性隨著溫度的升高而不斷增強(qiáng)，原生質(zhì)體的濃度和再生率不斷上升；當(dāng)酶解溫度高于32℃時(shí)，溶菌酶活性受到抑制，原生質(zhì)體的活性也開始降低，導(dǎo)致原生質(zhì)體的濃度和再生率下降。因此，酶解溫度以32℃為宜。

2.6 原生質(zhì)體紫外誘變劑量的確定

去除了細(xì)胞壁的原生質(zhì)體對外界的刺激非常敏感，考察玫瑰孢鏈霉菌D－30的原生質(zhì)體在紫外照射不同時(shí)間時(shí)的致死情況，結(jié)果如圖5所示。

通常紫外誘變的致死率多控制在70%～80%。由圖5可知，采用40s的紫外照射時(shí)間誘變玫瑰孢鏈霉菌D－30的原生質(zhì)體比較適宜。因此，確定在紫外燈功率為30W、照射距離為32cm、照射時(shí)間為40s的條件下進(jìn)行玫瑰孢鏈霉菌D－30原生質(zhì)體的紫外誘變。

圖5 紫外照射不同時(shí)間時(shí)達(dá)托霉素產(chǎn)生菌D－30原生質(zhì)體的致死率Fig.5 The death rate of protoplast of strain D－30 at different UV irradiation times

2.7 達(dá)托霉素高產(chǎn)菌株的選育

將菌種D－30按確定的最適條件進(jìn)行原生質(zhì)體的制備、誘變及再生，將再生得到的單菌落按1.7方法發(fā)酵培養(yǎng)，最終篩選得到達(dá)托霉素高產(chǎn)菌株D－35。將該菌株連續(xù)傳代5次，用HPLC檢測每代搖瓶發(fā)酵單位，達(dá)托霉素的產(chǎn)量波動均在3%以內(nèi)，表明其遺傳特性較穩(wěn)定。在10L發(fā)酵罐中進(jìn)行放大驗(yàn)證，菌株D－35的平均發(fā)酵單位與出發(fā)菌株相比提高了87.9%。

3 結(jié)論

（1）確定達(dá)托霉素產(chǎn)生菌玫瑰孢鏈霉菌D－30原生質(zhì)體制備及再生的最適條件為：在種子培養(yǎng)基中添加0.6%的甘氨酸，當(dāng)種子培養(yǎng)30h后，用濃度為2mg ·mL－1的溶菌酶破壁，酶解溫度為32℃，酶解時(shí)間為75min。

（2）紫外誘變處理最適條件下制得的D－30原生質(zhì)體，篩選得到高產(chǎn)菌株D－35，該菌株與出發(fā)菌株相比平均發(fā)酵單位提高了87.9%。表明通過紫外誘變達(dá)托霉素產(chǎn)生菌原生質(zhì)體來篩選達(dá)托霉素高產(chǎn)菌株是一種簡便高效的方法。

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