徐紅梅，何從林，熊文娟，韋燕禪，夏仕文

（重慶郵電大學(xué)生物信息學(xué)院，重慶400065）

磷酸肌酸（phosphocreatine，PCr）是參與細(xì)胞能量代謝的重要物質(zhì)之一，具有重要的藥理作用，如用于心臟外科手術(shù)病人術(shù)后心臟功能恢復(fù)、治療心肌梗塞等［1］。磷酸肌酸的制備方法主要有化學(xué)法和酶催化法。最早的化學(xué)法以肌酸和三氯氧磷為原料合成磷酸肌酸［2］，存在反應(yīng)條件苛刻、成本高、產(chǎn)率低且環(huán)境污染嚴(yán)重等問題，尤其是鋇鹽的引入增加了制劑的危險(xiǎn)性。美國專利［3］采用S－甲基異硫脲為原料，以二芐氧基磷?；?、氧化得到氰基磷酰胺，后者與肌氨酸縮合脫芐基再水解得到磷酸肌酸。湯磊等［4］以肌酐為原料，與二苯氧基磷酰氯縮合得到二苯氧基磷酰肌酐，再用二氧化鉑催化氫解脫去苯基，得到磷酸肌酐二鈉鹽，經(jīng)堿性水解得到磷酸肌酸，總收率35.5%。

肌酸激酶（creatine kinase，CK）是一種轉(zhuǎn)移性磷酰化酶，在堿性條件下可逆性催化肌酸和三磷酸腺苷（ATP）的轉(zhuǎn)磷?；磻?yīng)生成磷酸肌酸和二磷酸腺苷（ADP），用于合成磷酸肌酸具有反應(yīng)條件溫和、成本低廉、環(huán)境友好等特點(diǎn)［5］。但游離肌酸激酶只能一次性使用，而且作為外源蛋白會(huì)帶來分離困難、可能與磷酸肌酸原料藥和制劑發(fā)生免疫原性反應(yīng)等問題。

為尋求更理想的磷酸肌酸酶法合成工藝，作者提出一種新的肌酸激酶無載體固定化方法制得交聯(lián)肌酸激酶聚集體，并以肌酸和ATP為原料、交聯(lián)肌酸激酶聚集體為催化劑合成磷酸肌酸（圖1）。

圖1 交聯(lián)肌酸激酶聚集體催化合成磷酸肌酸Fig.1 Synthesis of phosphocreatine catalyzed by cross－linked creatine kinase aggregates

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑

肌酸，鄭州皇朝化工產(chǎn)品有限公司；ATP，湖北鴻運(yùn)隆藥業(yè)有限公司；磷酸肌酸、ADP、葡聚糖（MW＝40 000，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其余試劑均為市售國產(chǎn)分析純或色譜純。

1.2 方法

1.2.1 肌酸激酶的分離純化

按文獻(xiàn)［6］方法從兔肌中分離純化肌酸激酶。

1.2.2 交聯(lián)肌酸激酶聚集體的制備

取2g葡聚糖溶于50mL蒸餾水中，加入2.4g高碘酸鈉，室溫?cái)嚢?0min，反應(yīng)液透析至酸性淀粉碘化鉀溶液檢查無藍(lán)色，得56mL氧化葡聚糖溶液；向20mL肌酸激酶酶液中加入60mL 95%乙醇，4℃下攪拌2h，得到肌酸激酶聚集體；再向其中加入40 mL氧化葡聚糖溶液，室溫下反應(yīng)12h；最后加入20 mL 1mg·mL－1硼氫化鈉溶液，攪拌反應(yīng)2h，固體用純水洗滌2～3次，得到交聯(lián)肌酸激酶聚集體。

1.2.3 酶催化反應(yīng)

在含有60mmol·L－1肌酸、20mmol·L－1ATP和25mmol·L－1醋酸鎂的300mL 0.1mol·L－1甘氨酸－氫氧化鈉緩沖溶液（pH值9.0）中，加入36g交聯(lián)肌酸激酶聚集體（濕重），30℃下振蕩反應(yīng)6h。反應(yīng)過程中通過滴加2mol·L－1氫氧化鈉溶液控制反應(yīng)體系的pH值為9.0。

1.2.4 蛋白質(zhì)測(cè)定

酶蛋白濃度采用Bradford［8］分光光度法測(cè)定，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.5 酶活測(cè)定

在含有60mmol·L－1肌酸、20mmol·L－1ATP和25mmol·L－1醋酸鎂的20mL 0.1mol·L－1甘氨酸－氫氧化鈉緩沖溶液（pH值9.0）中，加入適量游離酶、相當(dāng)酶量的肌酸激酶聚集體或交聯(lián)肌酸激酶聚集體，30℃下振蕩反應(yīng)10min，加2mol·L－1鹽酸溶液終止反應(yīng)。采用HPLC測(cè)定磷酸肌酸的量，計(jì)算酶活。

1個(gè)酶活單位定義為：30℃下1min內(nèi)催化生成1μmol磷酸肌酸對(duì)應(yīng)的酶量（mg）。

1.2.6 分析方法

HPLC色譜條件：C18色譜柱（250mm×4.6 mm），流動(dòng)相20mmol·L－1磷酸鹽緩沖溶液（pH值6.6），流速1mL·min－1，檢測(cè)波長210nm，柱溫25℃。采用HPLC同時(shí)測(cè)定磷酸肌酸、肌酸、ATP和ADP。

2 結(jié)果與討論

2.1 交聯(lián)肌酸激酶聚集體制備條件的優(yōu)化

2.1.1 沉淀劑的影響

比較了硫酸銨、叔丁醇、聚乙二醇－6000、乙醇等沉淀劑對(duì)肌酸激酶聚集體形成的影響，結(jié)果見表1。

表1 沉淀劑對(duì)肌酸激酶沉淀率和相對(duì)酶活性的影響／%Tab.1 Effect of precipitant on creatine kinase precipieation rate and relative enzyme activity／%

由表1可知，以50%叔丁醇為沉淀劑時(shí)，不能形成肌酸激酶聚集體；以80%硫酸銨、20%聚乙二醇－6000為沉淀劑時(shí)，肌酸激酶的沉淀率較低，分別只有20%和10%；以95%乙醇為沉淀劑時(shí)，沉淀率達(dá)到90%，與游離酶相比的相對(duì)酶活性為65%。故選擇適宜的沉淀劑為95%乙醇。

2.1.2 交聯(lián)劑的影響

分別以戊二醛、京尼平、氧化葡聚糖為交聯(lián)劑對(duì)乙醇沉淀的肌酸激酶聚集體進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)，考察交聯(lián)劑對(duì)交聯(lián)肌酸激酶聚集體活性的影響，結(jié)果見表2。

表2 交聯(lián)劑對(duì)交聯(lián)肌酸激酶聚集體相對(duì)酶活性的影響／%Tab.2 Effect of cross－linker on relative enzyme activity of cross－linked creatine kinase aggregates／%

由表2可知，小分子交聯(lián)劑戊二醛、京尼平能夠交聯(lián)肌酸激酶聚集體，但相對(duì)酶活性很低，采用大分子交聯(lián)劑氧化葡聚糖制備的交聯(lián)肌酸激酶聚集體具有中等的相對(duì)酶活性。故選擇適宜的交聯(lián)劑為氧化葡聚糖。

2.2 交聯(lián)肌酸激酶聚集體的催化性能

2.2.1 最適反應(yīng)pH值和pH穩(wěn)定性

在不同pH值（4.0～12.0）下測(cè)定游離酶和交聯(lián)肌酸激酶聚集體及在30℃處理2h后的相對(duì)酶活性，結(jié)果分別見圖2、圖3。

圖2 交聯(lián)肌酸激酶聚集體的最適pH值Fig.2 The optimum pH value of cross－linked creatine kinase aggregates

由圖2可知，游離酶和交聯(lián)肌酸激酶聚集體的最適pH值分別為9.0和10.0。交聯(lián)肌酸激酶聚集體的最適pH值向堿性方向偏移了1個(gè)單位。

由圖3可知，在所選擇的pH值范圍內(nèi)尤其是在堿性條件下，交聯(lián)肌酸激酶聚集體的穩(wěn)定性明顯高于游離酶。

2.2.2 最適溫度和溫度穩(wěn)定性

在不同溫度（10～60℃）下測(cè)定游離酶和交聯(lián)肌酸激酶聚集體及在pH值9.0、50℃下處理不同時(shí)間的相對(duì)酶活性，結(jié)果分別見圖4、圖5。

圖3 30℃下處理2h的交聯(lián)肌酸激酶聚集體的pH穩(wěn)定性Fig.3 The pH stability of cross－linked creatine kinase aggregates treated at 30℃for 2h

圖4 交聯(lián)肌酸激酶聚集體的最適溫度Fig.4 The optimum temperature of cross－linked creatine kinase aggregates

由圖4可知，游離酶的最適溫度為40℃，交聯(lián)肌酸激酶聚集體的最適溫度為50℃，交聯(lián)肌酸激酶聚集體的最適溫度提高了10℃。

圖5 50℃下交聯(lián)肌酸激酶聚集體的熱穩(wěn)定性Fig.5 The thermal stability of cross－linked creatine kinase aggregates treated at 50℃

由圖5可知，游離酶和交聯(lián)肌酸激酶聚集體的相對(duì)酶活性隨處理時(shí)間的延長而急劇下降，30min時(shí)分別為50%和85%；180min時(shí)游離酶幾乎完全失活，交聯(lián)肌酸激酶聚集體仍有25%活性保留。顯然，交聯(lián)肌酸激酶聚集體的熱穩(wěn)定性明顯高于游離酶。

2.2.3 交聯(lián)肌酸激酶聚集體的操作穩(wěn)定性

測(cè)定交聯(lián)肌酸激酶聚集體催化合成磷酸肌酸的時(shí)間進(jìn)程，結(jié)果見圖6。

圖6 交聯(lián)肌酸激酶聚集體催化合成磷酸肌酸的時(shí)間進(jìn)程Fig.6 The time course of synthesis of phosphocreatine catalyzed by cross－linked creatine kinase aggregates

由圖6可知，反應(yīng)4h后達(dá)到平衡，轉(zhuǎn)化率（以ATP計(jì)）為74%。

反應(yīng)液中磷酸肌酸、肌酸、ATP和ADP的HPLC分離效果見圖7。

圖7 反應(yīng)液中磷酸肌酸、肌酸、ATP和ADP的HPLC分離效果Fig.7 Separation of phosphocreatine，creatine，ATP and ADP in reaction solution by HPLC

由圖7可知，HPLC分離反應(yīng)液中磷酸肌酸、肌酸、ATP和ADP效果良好，保留時(shí)間分別為2.7min、3.6min、4.3min和4.8min。

將交聯(lián)肌酸激酶聚集體與肌酸、ATP在30℃、pH值9.0的條件下，混合反應(yīng)4h，用Tris－HCl緩沖溶液（pH值9.0）充分洗滌后測(cè)定酶活，考察固定化酶的重復(fù)使用穩(wěn)定性，結(jié)果見圖8。

由圖8可知，交聯(lián)肌酸激酶聚集體使用4批次后，酶活保留90%以上；使用12批次后，酶活仍保留50%以上。

圖8 交聯(lián)肌酸激酶聚集體的操作穩(wěn)定性Fig.8 The operational stability of cross－linked creatine kinase aggregates

2.3 討論

制備交聯(lián)酶聚集體通常以戊二醛為交聯(lián)劑［8］，大分子交聯(lián)劑的運(yùn)用鮮有報(bào)道［9］。兔肌肌酸激酶是二聚體，由2個(gè)相同亞基組成，每個(gè)亞基又由387個(gè)氨基酸殘基組成，每個(gè)酶分子中存在8個(gè)巰基。本研究發(fā)現(xiàn)：以戊二醛為交聯(lián)劑時(shí)，由于其高反應(yīng)性和小尺寸，會(huì)與作為肌酸激酶結(jié)合或催化位點(diǎn)的巰基反應(yīng)導(dǎo)致失活；以大分子多醛如氧化葡聚糖為交聯(lián)劑時(shí)，肌酸激酶的相對(duì)酶活性很高。可能是因?yàn)槌叽巛^大的氧化葡聚糖較難進(jìn)入肌酸激酶的活性腔與催化相關(guān)的半胱氨酸殘基反應(yīng)，因而有較高的相對(duì)酶活性。

肌酸激酶可逆性催化肌酸和ATP的轉(zhuǎn)磷?；磻?yīng)，在堿性條件下，正反應(yīng)的反應(yīng)速度遠(yuǎn)大于逆反應(yīng)。與游離酶相比，交聯(lián)肌酸激酶聚集體具有更高的最適pH值、最適溫度，更好的pH穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性以及操作穩(wěn)定性。通過反應(yīng)條件如pH值、溫度、交聯(lián)肌酸激酶聚集體用量的優(yōu)化，并結(jié)合提高反應(yīng)底物之一肌酸濃度的策略，能夠有效提高磷酸肌酸的收率。

3 結(jié)論

（1）從兔肌中分離純化出肌酸激酶，經(jīng)95%乙醇沉淀得到肌酸激酶聚集體，再以氧化葡聚糖為交聯(lián)劑制備交聯(lián)肌酸激酶聚集體，沉淀率為90%，相對(duì)酶活性為58%。交聯(lián)肌酸激酶聚集體的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性顯著高于游離酶。

（2）交聯(lián)肌酸激酶聚集體在堿性條件下催化肌酸和ATP合成磷酸肌酸，轉(zhuǎn)化率（以ATP計(jì)）為74%。交聯(lián)肌酸激酶聚集體可重復(fù)使用12批次。

（3）與采用小分子交聯(lián)劑戊二醛相比，以大分子交聯(lián)劑氧化葡聚糖制備交聯(lián)肌酸激酶聚集體，能顯著減少酶活損失并有效提高其操作穩(wěn)定性，適合磷酸肌酸的規(guī)?；铣?。

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