胡秋實(shí)，蘇忠亮，李 江

（1.青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東青島266042；2.國家海洋局第一海洋研究所，山東青島266061）

生活在極端環(huán)境中的微生物為了適應(yīng)其生存環(huán)境，需要分泌特殊的酶類以及其它代謝產(chǎn)物，這些酶類和代謝產(chǎn)物所具有的特殊性質(zhì)在工業(yè)生產(chǎn)中具有很大的應(yīng)用價(jià)值［1－3］。

卡拉膠是從紅藻細(xì)胞壁中提取的以重復(fù)的1，3－β－D－吡喃半乳糖和1，4－α－D－吡喃半乳糖二糖單元為基本骨架交互連接而成的親水性線性硫酸多糖［4］，應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等眾多領(lǐng)域?？ɡz寡糖主要由卡拉膠經(jīng)酶降解得到，具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗凝血以及免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性［5－8］，在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值非常高。作者在此對(duì)印尼熱泉和北極海水這兩種極端環(huán)境的微生物產(chǎn)卡拉膠酶進(jìn)行了研究。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌株與培養(yǎng)基

菌株分離自印尼熱泉水樣和北極海水水樣，保存于國家海洋局海洋生物活性物質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室超低溫冰箱（－80℃）。

YN液體培養(yǎng)基（g·L－1）：蛋白胨3，酵母粉3，氯化鈉3，蒸餾水配制。

YN固體培養(yǎng)基（g·L－1）：蛋白胨3，酵母粉3，卡拉膠15，瓊脂粉15，氯化鈉3，蒸餾水配制。

YN斜面固體培養(yǎng)基（g·L－1）：蛋白胨5，酵母粉1，瓊脂粉15，氯化鈉3，蒸餾水配制。

2216E液體培養(yǎng)基（g·L－1）：蛋白胨5，酵母粉1，陳海水配制。

2216E固體培養(yǎng)基（g·L－1）：蛋白胨5，酵母粉1，卡拉膠15，瓊脂粉15，陳海水配制。

2216E斜面固體培養(yǎng)基（g·L－1）：蛋白胨5，酵母粉1，瓊脂粉15，陳海水配制。

1.2 方法

1.2.1 富集培養(yǎng)

取印尼熱泉／北極海水水樣0.1mL，加至含有30 mL YN／2216E液體培養(yǎng)基的100mL三角瓶中，于55℃／10℃以150r·min－1培養(yǎng)24h／48h。

1.2.2 初篩

用無菌生理鹽水適當(dāng)稀釋富集培養(yǎng)印尼熱泉／北極海水菌液，取0.1mL稀釋的菌液涂布于YN／2216E固體培養(yǎng)基平板中，于55℃／10℃恒溫培養(yǎng)24 h／48h；挑取單菌落劃線至YN／2216E固體培養(yǎng)基，于55℃／10℃恒溫培養(yǎng)24h／48h；將形成的單菌落挑至YN／2216E斜面固體培養(yǎng)基保藏，同時(shí)對(duì)單菌落進(jìn)行盧戈氏碘液染色，觀察菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈。

1.2.3 復(fù)篩

將具有卡拉膠降解活性的印尼熱泉／北極海水菌株劃線于YN／2216E固體培養(yǎng)基平板中，于55℃／10℃培養(yǎng)24h／48h，挑取單菌落于YN／2216E斜面固體培養(yǎng)基保藏，并對(duì)平板進(jìn)行盧戈氏碘液染色，進(jìn)行活性驗(yàn)證，確定透明圈大小。

1.2.4 酶活的測(cè)定

采用DNS法：取0.5mL印尼熱泉／北極海水菌株的酶液加入到1mL卡拉膠底物（含0.2%卡拉膠的0.2mol·L－1Glycine－NaOH緩沖溶液，pH值9.0）中，于55℃／10℃反應(yīng)15min，以100℃滅活10 min的酶液作對(duì)照，取1mL反應(yīng)物與1.5mL DNS試劑分別加入比色管中，沸水浴中加熱5min，立即冰浴冷卻至室溫，用蒸餾水定容至25mL，搖勻，以分光光度計(jì)于520nm處測(cè)光吸收值。

1個(gè)酶活力單位（U）定義為：在55℃／10℃下，1 min產(chǎn)生1μg的還原糖（以D－半乳糖計(jì)）所需要的酶量［9］。

根據(jù)半乳糖標(biāo)準(zhǔn)曲線確定產(chǎn)生的還原糖量。

1.2.5 卡拉膠酶的最適反應(yīng)溫度測(cè)定

將酶液與底物分別在溫度為10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃下反應(yīng)，其它條件不變，測(cè)定卡拉膠酶活性，確定卡拉膠酶的最適反應(yīng)溫度。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的篩選

2.1.1 印尼熱泉產(chǎn)卡拉膠酶菌株的篩選

通過稀釋涂布及劃線分離的方法從印尼熱泉水樣中獲得了84株菌，其中14株具有卡拉膠降解活性，進(jìn)一步通過平板劃線與盧戈氏碘液染色相結(jié)合的方法進(jìn)行復(fù)篩，結(jié)果如表1所示。

表1 印尼熱泉產(chǎn)卡拉膠酶菌株的篩選結(jié)果Tab.1 Screening of strains from Indonesian hot springs with carrageenase－producing activity

從表1可以看出，從印尼熱泉水樣中篩選出14株具有卡拉膠酶活性的菌株，其中，3株具有較弱的卡拉膠酶活性，7株具有一定的卡拉膠酶活性，4株具有較強(qiáng)的卡拉膠酶活性，選擇活性較強(qiáng)的菌株LI AIR 50－1、LI seawater－3、LI seawater－1和LI compur 50－1進(jìn)行后續(xù)研究。

2.1.2 北極海水產(chǎn)卡拉膠酶菌株的篩選

通過稀釋涂布及劃線分離的方法從北極海水水樣中獲得了157株菌，其中24株具有卡拉膠降解活性，進(jìn)一步通過平板劃線與盧戈氏碘液染色相結(jié)合的方法進(jìn)行復(fù)篩，結(jié)果如表2所示。

表2 北極海水產(chǎn)卡拉膠酶菌株的篩選結(jié)果Tab.2 Screening of strains from the Arctic seawater with carrageenase－producing activity

從表2可以看出，從北極海水水樣中篩選出24株具有卡拉膠酶活性的菌株，其中，11株菌具有較弱的卡拉膠酶活性，9株具有一定的卡拉膠酶活性，4株具有較強(qiáng)的卡拉膠酶活性，選擇活性較強(qiáng)的菌株CC1－2－3、BL09－3－5、BL09－8－2、C03－4－3進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 不同極端環(huán)境菌株產(chǎn)卡拉膠酶的最適反應(yīng)溫度（圖1）

從圖1可以看出，印尼熱泉菌在10℃時(shí)酶活性較低，隨著溫度的升高酶活性上升，在70℃達(dá)到最高；而北極海水菌在20℃時(shí)具有最高的酶活性，隨著溫度的升高，酶活性逐漸降低直至70℃失活。

2.3 討論

本研究選取印尼熱泉水樣和北極海水水樣中的微生物作為研究對(duì)象，篩選出了具有產(chǎn)卡拉膠酶能力的14株印尼熱泉菌和24株北極海水菌。經(jīng)過形態(tài)觀察，生理生化特性和16SrDNA序列分析，發(fā)現(xiàn)印尼熱泉菌均為Bacillus屬和Anoxybacillus屬，這些菌的最適生長溫度均為55℃，其中產(chǎn)卡拉膠酶量最高的菌株為LI compur 50－1、LI seawater－1、LI seawater－3和LI AIR 50－1，經(jīng)初步鑒定都屬于Anoxybacillus屬，其產(chǎn)卡拉膠酶的酶活力分別為15.4U·mL－1、14.3U· mL－1、15.8U·mL－1、14.8U·mL－1。這4株菌產(chǎn)生的卡拉膠酶的最適反應(yīng)溫度均在70℃以上，遠(yuǎn)高于一般的卡拉膠酶［10－15］，較高的熱穩(wěn)定性使得它們可以在高溫的工業(yè)環(huán)境中發(fā)揮催化作用。北極海水菌均為Pseudoalteromonas屬，這些菌的最適生長溫度均為10℃。其中產(chǎn)卡拉膠酶量最高的菌株為C03－4－3、BL09－3－5、CC1－2－3、BL09－8－2，其產(chǎn)卡拉膠酶的酶活力分別為16.1U·mL－1、17.5U·mL－1、19.5U· mL－1、16.2U·mL－1。這4株菌產(chǎn)生的卡拉膠酶的最適反應(yīng)溫度均為20℃左右，低于一般動(dòng)植物來源的卡拉膠酶［10－15］，不僅可以在低溫環(huán)境下發(fā)揮催化作用，而且其熱穩(wěn)定性較低，只需通過溫和的熱處理就可使酶失活，快速而經(jīng)濟(jì)地終止反應(yīng)。

圖1 反應(yīng)溫度對(duì)不同極端環(huán)境菌株產(chǎn)卡拉膠酶活性的影響Fig.1 Effect of reaction temperature on the activity of carrageenase produced by different extreme environment strains

3 結(jié)論

以實(shí)驗(yàn)室保存的印尼熱泉水樣和北極海水水樣中的微生物為對(duì)象，通過平板劃線、盧戈氏碘液染色和發(fā)酵上清液酶活測(cè)定等一系列定性定量相結(jié)合的方法，從兩種極端環(huán)境水樣中各篩選出4株具有高產(chǎn)卡拉膠酶能力的菌株，其中印尼熱泉菌和北極海水菌所產(chǎn)的卡拉膠酶的最適反應(yīng)溫度分別為70℃和20℃，這兩種酶分別對(duì)于高溫和低溫環(huán)境的工業(yè)生產(chǎn)具有非常大的應(yīng)用價(jià)值。

［1］ 王全富，繆錦來，李光友，等.南極微生物產(chǎn)低溫蛋白酶菌株的篩選、分子鑒定及部分酶活特性［J］.中國水產(chǎn)科學(xué)，2005，12（4）：437－444.

［2］ 祁丹丹，楊瑞金，華霄，等.天山凍土中產(chǎn)低溫蛋白酶菌株的篩選、鑒定及酶學(xué)性質(zhì)［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38（7）：32－37.

［3］ 曾倩，王毓舒，孫鯤，等.一株分離自北極海冰的產(chǎn)β－半乳糖苷酶的海單胞菌（Marinomonas sp.BSi20414）的篩選、鑒定和產(chǎn)酶條件研究［J］.極地研究，2011，23（2）：108－114.

［4］ MCLEAN M W，WILLIAMSON F B.κ－Carrageenase from Pseudomonas carrageenovora［J］.European Journal of Biochemistry，1979，93：553－558.

［5］ YUAN H，SONG J，LI X，et al.Immunomodulation and antitumor activity of kappa－carrageenan oligosaccharides［J］.Cancer Lett，2006，243（2）：228－234.

［6］ HU X K，JIANG X L，AUBREE E，et al.Preparation and in vivo antitumor activity of kappa－carrageenan oligosaccharides［J］.Pharmaceutical Biology，2006，44：646－650.

［7］ MOU H J，JIANG X L，GUAN H S.Aκ－carrageenan derived oligosaccharide prepared by enzymatic degradation containing antitumor activity［J］.Journal of Applied Phycology，2003，15（4）：297－303.

［8］ YAMADA T，OGAMO A，SAITTO T，et al.Preparation and anti－HIV activity of low－molecular－weight carrageenans and their sulfated derivatives［J］.Carbohydrate Polymers，1997，32（1）：51－55.

［9］ 顧燕松.紡織生物助劑果膠酶酶活的測(cè)定方法［J］.紡織科學(xué)研究，2002，13（3）：29－35.

［10］ 唐志紅，呂家森，張振，等.產(chǎn)卡拉膠酶海洋菌株的篩選和酶學(xué)性質(zhì)的初步研究［J］.食品科技，2011，36（6）：18－21.

［11］ POTIN P，SANSEAU A，LE GALL Y，et al.Purification and characterization of a newκ－carrageenase from a marine Cytophaga－like bacterium［J］.Eur J Biochem，1991，201：241－247.

［12］ MCLEAN M W，WILLIAMSON F B.kappa－Carrageenase from Pseudomonas carrageenovora Eur［J］.Biochem，1979，93（3）：553－558.

［13］ SARWAR G，SAKATA T，KAKIMOTO D.The production and characteristics of carrageenase from marine Cytophaga［J］.Bull Jap Soc Sci Fish，1983，49：1689－1694.

［14］ SARWAR G，MATAYOSHI S，ODA H.Purification of aκ－carrageenase from marine Cytophagaspecies［J］.Microbiol Immunol，1987，31：869－877.

［15］ 牟海津.酶法制備新卡拉四糖六糖的化學(xué)及生物學(xué)研究［D］.青島：中國海洋大學(xué)，2003.