倪孟祥，席煥鴿

（中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇南京210009）

人們曾經(jīng)認(rèn)為D－氨基酸在生物進(jìn)程中發(fā)揮著相對較少的作用，并稱之為“非天然氨基酸”。然而近期的研究表明，D－氨基酸在細(xì)胞結(jié)構(gòu)及信號調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用，科學(xué)家們認(rèn)為闡明D－氨基酸如何調(diào)控細(xì)胞壁重塑及生物被膜降解的機(jī)制不僅能夠?qū)?xì)胞質(zhì)外的進(jìn)程有一個新的理解，并且能夠促進(jìn)新療法的發(fā)展［1］。隨著研究的不斷深入，D－氨基酸在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和食品等領(lǐng)域的用途被迅速發(fā)掘，如D－氨基酸及其衍生物作為重要的手性原材料被廣泛地應(yīng)用于半合成抗生素、多肽激素、殺蟲劑和甜味劑等的合成中［2－5］。

目前，隨著應(yīng)用的推廣，D－氨基酸的工業(yè)需求量也逐漸增大。D－氨基酸制備方法主要有：對映體拆分法、化學(xué)合成法和生物法。酶法合成作為生物法中應(yīng)用最多的方法，具有無污染、反應(yīng)條件溫和、操作簡便、成本低、產(chǎn)物純度高等優(yōu)點，展現(xiàn)出很好的商業(yè)前景［6］。在酶法合成D－氨基酸的過程中，D－氨基?；甘侵饕褂玫膸追N酶之一。迄今已發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)D－氨基?；傅奈⑸锇óa(chǎn)堿菌屬、假單胞菌屬、貪噬菌屬、狹長平胞屬、擬無枝酸菌屬、博德特菌屬、葡萄糖菌屬、甲基桿菌屬、類諾卡氏菌屬、微桿菌屬、鏈霉菌屬和木霉屬等［7］。其中，來自產(chǎn)堿菌屬的D－氨基酰化酶已經(jīng)應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)［8］。然而，國內(nèi)對D－氨基酰化酶的研究還處于基礎(chǔ)階段，商品酶仍需進(jìn)口。

土壤篩選是獲得產(chǎn)酶微生物的重要途徑。作者從氨基酸類化工廠附近土樣中篩選產(chǎn)D－氨基酰化酶的菌株，并對活性較高的菌株進(jìn)行了鑒定及培養(yǎng)條件的初步優(yōu)化。

1 實驗

1.1 材料與試劑

土樣采自江蘇省某氨基酸類化工廠排污區(qū)附近。

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒，上海生工生物工程有限公司；250bp DNA Ladder Marker，寶生物工程（大連）有限公司；Taq DNA聚合酶，北京康為世紀(jì)有限公司；DNA引物（PAEG純），上海捷瑞公司；其它化學(xué)試劑均為分析純或色譜純。

1.2 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基：N－乙酰－D－甲硫氨酸1%，K2HPO4·3H2O 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，瓊脂2%，蒸餾水配制，調(diào)節(jié)pH值至7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：N－乙酰－D－甲硫氨酸1%，K2HPO4·3H2O 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，酵母浸膏2%，蒸餾水配制，調(diào)節(jié)pH值至7.0。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分離

采用平板稀釋法從土樣中分離菌株。取土壤樣品5g，用無菌生理鹽水逐級稀釋至10－1、10－2、10－3、10－4、10－5數(shù)量級，各取0.2mL均勻涂布于分離平板上，每個稀釋度涂3個平板，30℃倒置培養(yǎng)48h。觀察并挑選生長快速、菌落較大的菌株劃線純化，純化的菌株斜面置于4℃冰箱保存［9］。

1.3.2 菌株的篩選

1.3.2.1 初篩

將純化的菌株轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃、200 r·min－1搖瓶培養(yǎng)48h。低溫離心收集菌體，菌體用適當(dāng)比例的50mmol·L－1Tris－HCl緩沖溶液（pH值7.8）充分懸浮，加入適量200mmol·L－1的底物N－乙酰－D－甲硫氨酸至濃度為20mmol·L－1，混合均勻，于37℃恒溫水浴振蕩1h，之后立即沸水浴10min終止反應(yīng)。離心后取上清液1μL點樣進(jìn)行蛋氨酸的硅膠薄層層析，展開劑為V（正丁醇）∶V（冰乙酸）∶V（水）＝4∶1∶1。每次需展開劑25mL，另加入1mL 0.5%茚三酮溶液，混合均勻，展開結(jié)束后，電吹風(fēng)熱風(fēng)吹干；顯色斑點與0.05mmol·L－1蛋氨酸的標(biāo)樣斑點比較，檢測蛋氨酸的含量以反映D－氨基酰化酶的活力。為了消除所用試劑和菌體本身所含氨基酸對測定的干擾，將懸浮后的菌體先煮沸10min，然后加入底物，其余操作同上，作為空白對照。保留蛋氨酸斑點較大且無雜斑點的菌株進(jìn)行復(fù)篩［10］。

1.3.2.2 復(fù)篩

將初篩保留的菌株轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃、200r·min－1搖瓶培養(yǎng)48h；采用茚三酮比色法測定酶活［10］，方法同1.3.2.1。

酶活力單位（U）定義：在pH值7.8、37℃條件下，1min內(nèi)酶催化底物水解釋放出1μmol D－甲硫氨酸為1U。

1.3.3 菌株A55的鑒定

1.3.3.1 形態(tài)學(xué)特征觀察及生理生化特征測定

依據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》（第八版）［11］和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［12］進(jìn)行試驗，鑒定菌種。

1.3.3.2 菌株A55的16SrDNA序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析

利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株A55的基因組DNA。以基因組DNA為模板，用細(xì)菌16S rDNA基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增參數(shù)：94℃預(yù)變性4min；94℃解鏈40s，55℃退火40s，72℃延長1.5min，30個循環(huán)；最后72℃延長10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠檢測，純化后交南京思普金公司測序。將測序得到的16SrDNA序列通過Blast與GenBank中細(xì)菌及古菌的16SrDNA序列進(jìn)行比對，利用Mega5.2軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。采用鄰接法（neighbor－joining method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并對所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行自舉分析（bootstrap method，1 000次重復(fù)），估算其內(nèi)分支的支持率［13］。

1.3.4 影響D－氨基酰化酶合成的因素考察

以發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，考察培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH值、搖床轉(zhuǎn)速、搖瓶裝樣量、菌齡、碳源、氮源等對菌體生長及酶活力的影響，優(yōu)化菌株A55的培養(yǎng)條件［14］。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的分離及活性篩選

本實驗以N－乙?；琢虬彼嶙鳛榉蛛x培養(yǎng)基中的唯一碳氮源。從來自氨基酸類化工廠附近的8份土樣中，分離了約500株菌，并對其進(jìn)行了D－氨基?；富盍Φ某鹾Y與復(fù)篩，得到了酶活力及穩(wěn)定性均較好的菌株A55，酶活力達(dá)到70U，并對其進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 菌株A55的鑒定結(jié)果

2.2.1 形態(tài)學(xué)特征及生理生化特征（表1）

表1 菌株A55的生理生化特征Tab.1 Biochemical and physiological characteristics of strain A55

菌株A55在LB固體培養(yǎng)基上生長迅速，菌落圓形呈淡黃色，表面濕潤，中心凸起，邊緣整齊；在分離固體培養(yǎng)基上生長相對緩慢，菌落點狀呈乳白色，表面濕潤，邊緣整齊。革蘭氏染色陽性，桿狀，鏈狀排列。

2.2.2 16SrDNA序列分析

PCR擴(kuò)增得到的菌株A55的16SrDNA序列全長為1 416bp，將該序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中細(xì)菌及古菌的16SrDNA序列進(jìn)行Blast分析。結(jié)果表明，菌株A55與耐寒短桿菌相似度最高，達(dá)到100%，通過Mega5.2軟件得到了以16SrDNA序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。

由圖1可知，菌株A55與耐寒短桿菌Brevibacterium frigoritolerans處于同一分支，親緣關(guān)系最近，結(jié)合形態(tài)學(xué)及生理生化特征可以確定菌株A55為耐寒短桿菌。

2.3 菌株A55發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.3.1 培養(yǎng)條件的確定

圖1 菌株A55的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain A55

溫度及培養(yǎng)基pH值對微生物的生長有著非常重要的影響，搖床轉(zhuǎn)速及搖瓶裝樣量主要影響微生物的供氧，也是發(fā)酵中不可忽視的因素?？疾炝伺囵B(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH值、搖床轉(zhuǎn)速、裝樣量對菌株A55生長及酶活力的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 培養(yǎng)溫度（a）、培養(yǎng)基初始pH值（b）、搖床轉(zhuǎn)速（c）及裝樣量（d）對菌株A55生長及酶活力的影響Fig.2 Effects of culture temperature（a），culture initial pH value（b），shaker speed（c）and loaded liquid（d）on biomass and enzyme activity of strain A55

由圖2可知：菌株A55的最佳培養(yǎng)溫度為30℃，在此溫度下，菌體的生長情況及酶活力均較好；菌株A55在初始pH值為5的培養(yǎng)基上無法生長，其最適初始pH值為7；菌株A55發(fā)酵的最佳搖瓶轉(zhuǎn)速為200 r·min－1，最佳裝樣量為15%，這與菌株A55嚴(yán)格好氧密切相關(guān)。因此，確定菌株A55適宜的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)基初始pH值7，搖瓶轉(zhuǎn)速200r·min－1，搖瓶裝樣量15%。在此條件下繼續(xù)考察其它因素的影響。

2.3.2 菌齡對菌株生長及酶活力的影響

菌株A55所產(chǎn)的D－氨基?；笇儆谡T導(dǎo)酶，只有在培養(yǎng)基中添加N－乙?；被嶙鳛檎T導(dǎo)物時，菌株才能合成D－氨基酰化酶。菌株A55的生長曲線及菌齡對酶活力的影響見圖3。

圖3 菌株A55的生長曲線（a）及菌齡對酶活力的影響（b）Fig.3 Growth curve of strain A55（a）and effect of strain age on enzyme activity（b）

由圖3a可知，由于種子培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基相同，菌株A55調(diào)整期非常短暫，很快進(jìn)入對數(shù)期，在第8h即進(jìn)入穩(wěn)定期。由圖3b可知，菌株A55在36～60h之間D－氨基?；富盍^高，第72h活力明顯降低，可以判斷菌株A55從第60h開始進(jìn)入衰亡期。因此，確定菌株的最佳培養(yǎng)時間為48h，酶活力達(dá)到82.99U。

2.3.3 碳、氮源對菌株生長及酶活力的影響

分別添加1%的葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘油，0.5%的硝酸鈉、硫酸銨、尿素、蛋白胨，以發(fā)酵培養(yǎng)基為對照，考察不同碳、氮源對菌株A55的生長及酶活力的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 碳源（a）和氮源（b）對菌株A55生長及酶活力的影響Fig.4 Effects of carbon sources（a）and nitrogen sources（b）on biomass and enzyme activity of strain A55

由圖4a可知，在培養(yǎng)基中分別添加不同碳源后，菌株A55的菌體量均明顯增加，葡萄糖的影響尤其突出，菌體量增加至對照的2.08倍；然而D－氨基?；富盍黠@降低。由圖4b可知，硝酸鈉、硫酸銨及尿素等無機(jī)氮源對菌株A55的菌體量影響不大，D－氨基?；富盍τ兴档?；相比之下，蛋白胨的添加使菌株A55的菌體量增加至對照的2.78倍，同時蛋白胨對D－氨基?；富盍τ绊懸草^大，使其降低至對照的24.67%。表明，培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富反而抑制D－氨基酰化酶的合成，這與該酶屬于誘導(dǎo)酶密切相關(guān)。

3 結(jié)論

從氨基酸類化工廠附近土樣中分離出產(chǎn)D－氨基?；傅木闍55，通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征測定及16SrDNA系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定其為短桿菌屬的耐寒短桿菌，具有D－氨基酰化酶活力的耐寒短桿菌此前未見報道。另外，對該菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行了初步優(yōu)化，其最佳產(chǎn)酶發(fā)酵條件為：培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)基初始pH值7，搖床轉(zhuǎn)速200r·min－1，搖瓶裝樣量15%，培養(yǎng)時間48h。為實現(xiàn)國內(nèi)D－氨基?；傅纳唐坊懊阜ê铣蒁－氨基酸的工業(yè)化奠定了基礎(chǔ)。

［1］ CAVA F，LAM H，de PEDRO M A，et al.Emerging knowledge of regulatory roles of D－amino acids in bacteria［J］.Cell Mol Life Sci，2011，68（5）：817－831.

［2］ SHINADA T，ISHIDA T，HAYASHI K，et al.Synthesis of leucine－enkephalin analogs containingα－amino squaric acid［J］.Tetrahedron Letters，2007，48（43）：7614－7617.

［3］ NAGATA Y，HIGASHI M，ISHII Y，et al.The presence of high concentrations of free D－amino acids in human saliva［J］.Life Sciences，2006，78（15）：1677－1681.

［4］ CIACCIO C，TUNDO G R，GRASSO G，et al.Somatostatin：A novel substrate and a modulator of insulin－degrading enzyme activity［J］.Journal of Molecular Biology，2009，385（5）：1556－1567.

［5］ MIYOSHI Y，KOGA R，OYAMA T，et al.HPLC Analysis of naturally occurring free D－amino acids in mammals［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2012，69：42－49.

［6］ 于平.生物轉(zhuǎn)化和手性拆分技術(shù)制備D－氨基酸研究進(jìn)展［J］.生物學(xué)通報，2005，40（9）：3－5.

［7］ LIU J，ASANO Y，IKOMA K，et al.Purification，characterization，and primary structure of a novel N－acyl－D－amino acid amidohydrolase from Microbacterium natoriense TNJL143－2［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2012，114（4）：391－397.

［8］ WAKAYAMA M，YOSHIMUNE K，HIROSE Y，et al.Production of D－amino acids by N－acyl－D－amino acid amidohydrolase and its structure and function［J］.Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2003，23（2－6）：71－85.

［9］ 倪孟祥，胡穎.北極海泥來源抗菌活性真菌的篩選及菌株H5的初步研究［J］.化學(xué)與生物工程，2013，30（5）：61－64.

［10］ 劉偉.產(chǎn)D－氨基?；妇甑倪x育［D］.杭州：浙江大學(xué)，2007.

［11］ R E布坎南，N E吉本斯.伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊［M］.第八版，北京：科學(xué)出版社，1984.

［12］ 東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊［M］.北京：科學(xué)出版社，2001.

［13］ 趙章鎖，郝曉潔，魏聰，等.苯酚降解菌SW34的鑒定［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（31）：15372－15374.

［14］ 滿永博，范季瀛，蘇剛，等.培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基組分對粘質(zhì)沙雷氏菌生長及產(chǎn)D－乳酸的影響［J］.化學(xué)與生物工程，2013，30（7）：56－60.