李文超，張迎建，楊紅

(東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點實驗室,江蘇 南京 210009)

肺纖維化是一組由多種病因引起的肺破壞性疾病,包括繼發(fā)因素導(dǎo)致的肺纖維化和特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF),其病理過程為當(dāng)肺內(nèi)纖維母細胞受到物理、化學(xué)或生物因素作用時分泌膠原蛋白修補肺間質(zhì)組織,進而造成肺纖維化。肺纖維化的典型特征是肺間質(zhì)中膠原和細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)過度沉積,且普遍伴有轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)[1]及白細胞介素(IL)- 1、- 6等多種炎癥介質(zhì)的表達增加。環(huán)境、物理、藥物、個體差異與遺傳因素等均與肺纖維化發(fā)生有關(guān),但其具體機制仍不明確。由于微小RNA(microRNA,miRNA)參與細胞增殖、分化、凋亡等多種生物進程,其表達異常會導(dǎo)致組織器官的癌變及纖維化等疾病[2- 4],因此miRNA對肺纖維化的基因表達調(diào)控日益成為研究的熱點。近年來,一些研究結(jié)果顯示,miRNA與肺纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]。在本文中作者對幾種miRNA在肺纖維化過程中所起作用的最新進展作一綜述,以期為深入了解肺纖維化的發(fā)生機制及防治措施提供新思路。

1 miRNA表達譜技術(shù)

miRNA表達譜是指通過構(gòu)建處于某一特定狀態(tài)下的細胞或組織的cDNA文庫,收集cDNA序列片段,定性、定量分析其miRNA群體組成,從而描繪該特定細胞或組織在特定狀態(tài)下的miRNA表達種類和豐度信息,編制成的數(shù)據(jù)表就稱為miRNA表達譜。miRNA表達譜分析技術(shù)是基于核酸雜交和擴增的原理。miRNA表達譜的研究主要分為3個階段,即miRNA的初步篩選、差異表達分析和調(diào)控機制研究。對于miRNA表達譜檢測技術(shù)有多種選擇。針對miRNA初步篩選的克隆測序類技術(shù),主要有454焦磷酸測序技術(shù)、Solexa合成測序技術(shù)和SOLiD連接測序技術(shù)[6]等;對于miRNA表達譜分析的高通量芯片技術(shù),包括固相微陣列芯片和Luminex- xMAP液態(tài)芯片技術(shù)[7];實時熒光定量PCR(qPCR)和經(jīng)典的Northern印跡等技術(shù)廣泛應(yīng)用于研究miRNA表達調(diào)控機制。對miRNA表達譜的研究方法還有引物入侵法[8]、橋連同位素標(biāo)記法[9]、納米金標(biāo)法[10]、單分子檢測法[11]等,由于這些技術(shù)缺乏一定的高通量特性、靈敏性或因其耗時長、成本高,在科研應(yīng)用中有一定的局限性。

在正常生理和病理狀態(tài)下,了解miRNA的時空表達特性是全面理解miRNA功能的基礎(chǔ),miRNA表達譜分析和生物信息學(xué)方法預(yù)測靶基因為認(rèn)識miRNA的功能提供了新視角,以期通過整合調(diào)控miRNA表達的上游轉(zhuǎn)錄因子和miRNA的下游靶標(biāo),建立一個miRNA調(diào)控的包含細胞分化和代謝的遺傳通路和網(wǎng)絡(luò),闡明miRNA相關(guān)網(wǎng)絡(luò)的混亂會如何引起病損,最終為疾病的早期發(fā)現(xiàn)和診斷以及治療提供新的切入點。

2 miRNA在肺纖維化中的表達調(diào)控

2.1 miR- 29

研究發(fā)現(xiàn),miR- 29在不同的組織細胞中表達不同,尤其是在肺、腎臟和心臟組織細胞中表達量顯著增加[12],因其可抑制TGF-β1的致纖維化通路以及ECM的合成,并有抗纖維化的功效而備受關(guān)注[13]。Cushing等[14]發(fā)現(xiàn),miR- 29和其下游靶基因COL3A1、COL4A1的表達在博萊霉素誘導(dǎo)的肺間質(zhì)纖維化發(fā)展過程中呈負調(diào)節(jié)作用。miR- 29調(diào)節(jié)與纖維化相關(guān)的大多數(shù)基因,包括COL1A1、COL1A2、COL3A1等,在與纖維化相關(guān)的45個基因中有23個(51%)確定為miR- 29的目標(biāo)基因。TGF-β1可使所有的miR- 29家族成員表達下調(diào),下調(diào)的miR- 29可能導(dǎo)致TGF-β1的控制基因脫抑制。miR- 29作為TGF-β1的下游基因,通過調(diào)節(jié)TGF-β1的信號強度調(diào)節(jié)與纖維化相關(guān)的大多數(shù)基因表達,進而影響膠原蛋白以及層粘連蛋白的產(chǎn)生。因此,miR- 29是肺纖維化的一個主要調(diào)節(jié)相關(guān)基因。

Jun 等[15]發(fā)現(xiàn),miR- 29是Smad3的一個下游靶基因,在博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺間質(zhì)纖維化過程中受TGF-β/Smad信號的負調(diào)控。同時,miR- 29的過度表達可能負反饋調(diào)節(jié)TGF-β和結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)的表達以及Smad3信號通路。將睡美人(sleeping beauty,SB)介導(dǎo)的miR- 29基因轉(zhuǎn)移到正常的和病變的肺組織中,可以對肺間質(zhì)纖維化起到預(yù)防和治療的效果。因此,對miR- 29的進一步研究可能為治療肺間質(zhì)纖維化提供靶向藥物和新的治療方向。

2.2 miR- 21

miR- 21被發(fā)現(xiàn)與肺纖維化過程中肌成纖維細胞分化有關(guān)。Liu等[16]的研究顯示,在博來霉素誘導(dǎo)肺纖維化實驗小鼠和IPF患者肺組織中,miR- 21主要集中于肌成纖維細胞中且表達上調(diào)。研究人員推測,miR- 21可能通過抑制Smad蛋白、Smad7的表達從而實現(xiàn)對纖維化的調(diào)控。給予miR- 21反義核苷酸探針可以明顯降低實驗小鼠的纖維化程度,并且α- 平滑肌激動蛋白(α- smooth muscleactin,α- SMA,肌成纖維細胞特異性標(biāo)志)表達不增加。TGF-β1可以增加初級肺纖維母細胞內(nèi)的miR- 21表達,miR- 21水平升高進而可以增強纖維母細胞內(nèi)TGF-β1的促纖維化作用,反之,將miR- 21進行基因沉默后可削弱其促纖維化能力,這說明miR- 21在誘導(dǎo)肌成纖維細胞分化中起重要作用。

2.3 miR- 155

miR- 155因在成纖維細胞中抑制角質(zhì)細胞生長因子(keratinocyte growth factor,FGF7/KGF)的表達并增加其遷移而引起關(guān)注。Martin等[17]首次發(fā)現(xiàn)miR- 155的纖維化相關(guān)指標(biāo)是Ⅰ型血管緊張素Ⅱ受體(AT1受體)。另有研究發(fā)現(xiàn),AT1在博來霉素處理的小鼠與IPF患者的肺間隙成纖維細胞中表達增加[18],其水平的增加可導(dǎo)致成纖維細胞中膠原蛋白合成的活性增強,進而影響肺纖維化進程[19]。

Pottier 等[20]研究發(fā)現(xiàn),miR- 155的表達上調(diào)可由腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和IL- 1β引起,而其下調(diào)可由TGF-β引起。該研究顯示,FGF7/KGF是miR- 155的一個目標(biāo)。miR- 155可與FGF7/KGF的3′- UTR結(jié)合,下調(diào)FGF7/KGF。同時,miR- 155在特發(fā)性肺纖維化患者的肺組織中的表達上調(diào)[21]。這些研究結(jié)果提示miR- 155在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化機制的調(diào)節(jié)中起重要作用。

2.4 miR- 149

對miR- 149的研究表明,miR- 149在細胞增殖、凋亡及炎癥反應(yīng)中可能發(fā)揮重要作用。miR- 149在舌鱗癌以及腎透明細胞癌中表達降低[22- 23],在鼻咽癌組織中表達增加[24]。在對鼻咽癌組織的研究發(fā)現(xiàn),miR- 149通過抑制E- 鈣黏蛋白的表達參與了上皮細胞向間質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)化(epithelial- to- messenchymal,EMT)過程[25],而EMT是肺纖維化早期的一個重要體現(xiàn),因此miR149有可能導(dǎo)致肺纖維化。Wang等[26]在研究前體miRNA的常見基因突變與罹患煤工塵肺風(fēng)險的關(guān)系時發(fā)現(xiàn),位于miR- 149前體的rs2292832單核苷酸多態(tài)性位點TT基因型可明顯增加煤工塵肺的患病風(fēng)險。王莎莎等[27]對一期、二期、三期煤工塵肺病人共27例進行了全基因組miRNA測序、靶基因預(yù)測及信號通路分析等,發(fā)現(xiàn)在所有病例組變化方向一致的miRNA中,miR- 149表達下調(diào)。在此基礎(chǔ)上,制備矽塵誘導(dǎo)肺纖維化小鼠模型,檢測到肺組織內(nèi)miR- 149表達下調(diào)、IL- 6表達上調(diào),肺泡壁中有大量炎癥細胞浸潤,肺泡結(jié)構(gòu)略有增厚;體外實驗中,經(jīng)矽塵處理的呼吸系統(tǒng)上皮細胞中同樣也檢測到miR- 149的表達降低以及IL- 6的表達增多,而上皮細胞是矽塵引起肺纖維化早期的主要效應(yīng)細胞之一。這說明SiO2粉塵可導(dǎo)致小鼠肺組織產(chǎn)生炎癥反應(yīng),miR- 149的下調(diào)及IL- 6的上調(diào)可能參與了肺部炎癥、肺纖維化等疾病的發(fā)生過程。這可能為進一步揭示肺纖維化的發(fā)病機制提供理論依據(jù)。

2.5 let- 7d

Let- 7家族是近年來研究較多的一類miRNA,最早在研究線蟲時被發(fā)現(xiàn),參與調(diào)控細胞分化和增殖時序。其中,let- 7d位于肺泡上皮細胞內(nèi),與肺纖維化密切相關(guān)。Marshall等[19]研究結(jié)果顯示,在肺纖維化尤其是IPF病人中,let- 7d的表達顯著降低。let- 7d表達減少可導(dǎo)致膠原蛋白沉積增加,肺泡間隔增厚。在體外試驗中[28],let- 7d與TGF-β1關(guān)系密切,TGF-β1可抑制let- 7d的表達。let- 7d與肺泡內(nèi)皮細胞間質(zhì)HMGA2(high mobility group AT- hook 2)、ACTA2及COLIA1的表達呈負相關(guān),并使內(nèi)皮標(biāo)志物CDH1、TJP1表達降低。其中,HMGA2是let- 7d的一個已知靶位點[29],同時是EMT的調(diào)節(jié)器[30]。而在體內(nèi)試驗中[28],抑制let- 7d的表達可使肺泡壁增厚,而將miRNA高效阻斷劑通過氣管給藥從而抑制let- 7d的表達,結(jié)果導(dǎo)致了EMT的發(fā)生,進而引起肺纖維化。由此可見,抑制let- 7d的表達可能是肺纖維化中細胞表型顯著變化的一個關(guān)鍵調(diào)控點,可能為肺纖維化尤其是IPF的治療提供新思路。

2.6 miR- 200

Gregory等[31]發(fā)現(xiàn)miR- 200家族通過E- 鈣黏蛋白的轉(zhuǎn)錄抑制因子ZEB1和SIP1靶向調(diào)節(jié)EMT,增強其表達可阻止TGF-β誘導(dǎo)EMT的發(fā)生。Yang等[32]報道,miR- 200家族在博萊霉素致肺纖維化小鼠的肺部(主要為miR- 200a、miR- 200b和miR- 200c)和IPF患者的肺內(nèi)(主要為miR- 200a、miR- 200c)表達顯著下調(diào)。miR- 200家族在肺泡上皮細胞中表達量高于肺成纖維細胞,并且可以通過抑制由TGF-β1誘發(fā)的肺泡上皮細胞的EMT,從而起到抗纖維化作用。由此,miR- 200家族在肺纖維化發(fā)生過程中起重要作用,增強其在肺部的表達有可能成為一種新的治療肺纖維化疾病的方法。

2.7 其他

研究發(fā)現(xiàn),在囊腫性肺纖維化病人的肺內(nèi)上皮細胞中,與非囊腫性肺纖維化病人的肺組織相比較,miR- 126的表達水平降低。miR- 126可調(diào)節(jié)TLR2/4信號通路的TOM1基因的表達,而其表達下調(diào)可導(dǎo)致TOM1基因的表達增加[33- 34]。這表示miR- 126可能與肺纖維化的發(fā)生相關(guān)。

同時,IPF患者的肺成纖維細胞中miR- 17～92簇的表達下調(diào)[35],miR- 154表達上調(diào)[36]。

3 miRNA與肺纖維化的治療

miRNA轉(zhuǎn)錄后可調(diào)控mRNA,這可能調(diào)控著至少1/3的人類編碼蛋白基因[37- 39]。較多的研究表明,miRNA在肺纖維化中起到調(diào)控作用,尤其是miR- 29、miR- 21、miR- 149等。 miR- 29可引發(fā)特定傳導(dǎo)信號,導(dǎo)致膠原蛋白以及層粘連蛋白的產(chǎn)生,從而使ECM的沉積增加或減少;miR- 21和miR- 155可調(diào)節(jié)肺成纖維細胞的分化和增殖;miR- 149則是通過參與免疫因子調(diào)控進而影響肺纖維化進程。這些miRNAs的異常表達可以影響肺纖維化疾病的發(fā)生。因此,可以選擇特定的miRNA干預(yù)其靶基因所調(diào)控的疾病的發(fā)生發(fā)展。理論上,對于miRNA表達增加的疾病,給予反義核苷酸(如LNA反義寡核苷酸)阻斷miRNA的活性[40],或者通過干預(yù)相關(guān)活化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(如巨噬細胞NF- κB信號通路)[41],從而恢復(fù)其正常調(diào)節(jié)水平;而對于miRNA表達減少所致的疾病,通過構(gòu)建相關(guān)表達載體,將含有目標(biāo)miRNA導(dǎo)入體內(nèi)重建其表達,以期達到治療疾病的目的。

隨著對miRNA及其靶mRNA研究的深入,將更有利于完善對 miRNAs在肺組織中的生理調(diào)節(jié)、疾病發(fā)生和發(fā)展中作用的理解,為疾病的預(yù)防[42]、臨床診斷及治療提供新的依據(jù)和方向。

4 小結(jié)與展望

miRNA自從被發(fā)現(xiàn)以來,其相關(guān)調(diào)控疾病機制的研究取得了巨大進展。由于檢測miRNA表達方法的技術(shù)平臺不斷發(fā)展,這為研究miRNA引發(fā)肺纖維化的機制、早期診斷以及相關(guān)治療開發(fā)了新視角。盡管對miRNA的研究越來越多,但目前對肺纖維化中miRNA的表達調(diào)控具體機制了解甚少。同時,將miRNA應(yīng)用于臨床診斷和治療仍有一些亟待解決的問題,如：肺纖維化特別是IPF的發(fā)病機理并不明確,miRNA在其中發(fā)揮的作用還有待進一步實驗證實;miRNA差異表達的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)尚未清楚;將miRNA導(dǎo)入體內(nèi)的最佳途徑以及如何使其發(fā)揮作用等。相信在不久的將來,miRNA作為特異、靈敏的新型生物標(biāo)記物,會為研究肺纖維化的發(fā)生發(fā)展提供新思路,為肺纖維化的診斷、治療和預(yù)后判斷開發(fā)新視野。

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