陳婧，何友吉

(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 微生物與免疫學(xué)系，江蘇 南京 210009)

結(jié)直腸癌已發(fā)展成為中國(guó)第五大癌癥殺手[1]，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌患者的主要死因，40%～50%的患者在原發(fā)灶切除后發(fā)生肝轉(zhuǎn)移。不可手術(shù)的肝轉(zhuǎn)移患者盡管有靶向藥物的使用，其中位生存期仍不超過(guò)2年。因此，盡早發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移對(duì)于判斷結(jié)直腸癌患者的預(yù)后以及是否需要采取干預(yù)措施至關(guān)重要。

腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。腫瘤轉(zhuǎn)移的“宿命論”認(rèn)為，決定腫瘤生物學(xué)行為及臨床表型的遺傳學(xué)改變?cè)谠l(fā)腫瘤中已經(jīng)存在[2]，該學(xué)說(shuō)已被Van’t Veer等用芯片技術(shù)在乳腺癌的原發(fā)灶中證實(shí)[3]。

在結(jié)直腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，肝轉(zhuǎn)移灶中的DNA拷貝數(shù)譜及基因表達(dá)譜與其原發(fā)灶高度相似，與上述“宿命”模型一致[4- 5]，表明從結(jié)直腸癌的原發(fā)灶出發(fā)能夠找出預(yù)測(cè)其肝轉(zhuǎn)移的生物學(xué)指標(biāo)。在對(duì)結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞株展開(kāi)的大量分子和細(xì)胞遺傳學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌的發(fā)展有明確的病理階段，每個(gè)階段有特異的癌/抑癌基因的突變[6]。這些改變發(fā)生的關(guān)鍵機(jī)制是基因組的不穩(wěn)定，可歸納為兩種方式：由DNA錯(cuò)配修復(fù)缺陷導(dǎo)致的微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability， MIN or MSI)，僅占15%，其腫瘤細(xì)胞通常保持正常的二倍體狀態(tài)；另一種則是在染色體水平上呈現(xiàn)的基因組不穩(wěn)定性，即由于染色體不穩(wěn)定(chromosomal instable，CIN)而產(chǎn)生非整倍體(aneuploidy)的變化，占85%。

本文中作者對(duì)目前正在從染色體、基因、蛋白等各水平尋找與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移相關(guān)分子標(biāo)志物的文獻(xiàn)進(jìn)行綜述。

1 與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移相關(guān)的染色體變異

基于現(xiàn)有aCGH(array comparative genomic hybridization)和SNP(single nucleotide polymorphism)的研究，結(jié)直腸癌中常被報(bào)道的染色體改變包括7， 8q， 13q 和20q的擴(kuò)增及4， 8p，14q， 15q， 17p 和18q的缺失[7- 9]，現(xiàn)已證實(shí)DNA拷貝數(shù)的變化發(fā)生在特定模式下，并與不同的臨床表現(xiàn)相關(guān)[10- 12]。

目前SNP芯片的分辨率已經(jīng)能夠檢測(cè)到染色體上小于2.5kb有變異的區(qū)域，Sayagues J.M等用高分辨率的SNP(500K)檢測(cè)了23例肝轉(zhuǎn)移患者的原發(fā)灶，發(fā)現(xiàn)7， 8q，11q，13q，20q和X的擴(kuò)增以及1p， 8p， 17p，18q的缺失最為常見(jiàn)。該研究認(rèn)為，在變異染色體中4種重現(xiàn)的斷裂點(diǎn)位于1p1，8p12，17p11.2，20p12.1，又以17p11.2最為多見(jiàn)[13]。

采用FISH、aCGH技術(shù)，以發(fā)生肝轉(zhuǎn)移和未發(fā)生轉(zhuǎn)移或肝外臟器轉(zhuǎn)移的原發(fā)性結(jié)直腸癌為標(biāo)本進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移患者原發(fā)灶中染色體變化最為明顯的是20q，其擴(kuò)增倍數(shù)明顯高于未發(fā)生肝轉(zhuǎn)移組[5，14]，還有一部分染色體的變化表現(xiàn)為8q的擴(kuò)增及18q的缺失[5，15]。

2 變異的染色體上與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移相關(guān)的候選基因(蛋白)

2.1 鋅指蛋白 217(ZEN217)

原癌基因ZEN217定位于20q13.2，被認(rèn)為是有可能驅(qū)動(dòng)20q13擴(kuò)增的靶分子。在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移灶中，ZEN217出現(xiàn)擴(kuò)增的頻率明顯高于原發(fā)灶，未發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的患者其原發(fā)灶未出現(xiàn)該基因的多拷貝，提示ZEN217的擴(kuò)增增加了結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)[16]。

2.2 細(xì)胞凋亡易感蛋白(chromosome segregation 1- like，CSE1L)

定位于20q13.13，編碼一種輸出蛋白，介導(dǎo)經(jīng)典核定位信號(hào)(NLS)通路中輸入蛋白-α的回收[17]。研究發(fā)現(xiàn)CSE1L/CAS的mRNA在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)高于正常腺體細(xì)胞，該基因被干擾后結(jié)直腸癌細(xì)胞黏附能力下降，凋亡比例增加。免疫組化的方法顯示，CSE1L/CAS在結(jié)直腸癌細(xì)胞胞質(zhì)中的高表達(dá)與高TNM分期及浸潤(rùn)深度相關(guān)，高表達(dá)CSE1L/CAS的結(jié)腸癌細(xì)胞系HT- 29具有向肝臟轉(zhuǎn)移的高風(fēng)險(xiǎn)，5/7的小鼠在注射HT- 29后出現(xiàn)肝臟轉(zhuǎn)移灶而無(wú)其他臟器轉(zhuǎn)移，提示該蛋白參與了結(jié)直腸癌細(xì)胞的肝轉(zhuǎn)移過(guò)程[18]。

2.3 轉(zhuǎn)錄因子 E2F- 1

多種腫瘤細(xì)胞經(jīng)常高表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子E2F1[19]，基因定位于20q11.2， E2F1游離化后活化S期相關(guān)蛋白?，F(xiàn)認(rèn)為，E2F1活性的調(diào)節(jié)紊亂是腫瘤形成過(guò)程中的一個(gè)始發(fā)事件。通過(guò)芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)了越來(lái)越多的E2F1的靶分子，這些分子本身或它們作用的次級(jí)蛋白可能在轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮了作用。Marian等用CGH及q- PCR的方法發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌肝、肺轉(zhuǎn)移灶中20q有普遍的擴(kuò)增(16/18)，而E2F1拷貝數(shù)目在肝、肺轉(zhuǎn)移灶中均值為4.1、3.9，在原發(fā)灶中的拷貝數(shù)為2.52[20]。

2.4 結(jié)直腸癌缺失蛋白(DCC)

定位于18q21.2，是公認(rèn)的抑癌基因，編碼一種穿膜蛋白，表達(dá)于大部分正常組織以及腸黏膜上，參與細(xì)胞- 細(xì)胞以及細(xì)胞- 基質(zhì)間的相互調(diào)節(jié)，影響細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及轉(zhuǎn)移的發(fā)生[21]。18號(hào)染色體的缺失在腺瘤向浸潤(rùn)性腫瘤的發(fā)展過(guò)程中呈上升趨勢(shì)[22]，DCC被認(rèn)為是這種雜合性缺失的靶基因。原發(fā)灶中DCC的缺失與患者的預(yù)后不良相關(guān)[23]，并可作為結(jié)直腸癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)指標(biāo)，雖然這種預(yù)測(cè)的敏感性可能與患者的分期相關(guān)，在所有患者中敏感性為42%，特異性為71%，在Ⅱ期患者中陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為19%，陰性預(yù)測(cè)值為88%[24]。

2.5 Smad4(DPC4)

定位于18q21.1，該基因產(chǎn)物是TGF-β信號(hào)通路中介導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育相關(guān)的中間產(chǎn)物，Smad4與Smad2、Smad3形成一種復(fù)合物作用于細(xì)胞核上，并在此激活TGF-β轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的多個(gè)相關(guān)基因[25]。已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道，Smad4表達(dá)的變化更多出現(xiàn)在進(jìn)展性結(jié)直腸癌以及轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌中。免疫組化的方法顯示，轉(zhuǎn)移灶比原發(fā)灶更易發(fā)生Smad4缺失，肝轉(zhuǎn)移灶比肝外轉(zhuǎn)移灶的缺失更易發(fā)生[26]，當(dāng)給Balb/c小鼠注射CT26- Smad4下調(diào)的細(xì)胞系時(shí)，小鼠發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)增加且小鼠肝轉(zhuǎn)移灶的重量明顯高于對(duì)照組，發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的小鼠平均生存時(shí)間明顯低于對(duì)照組(26dvs44.5d)，說(shuō)明Smad4能夠抑制CT26在體內(nèi)的肝轉(zhuǎn)移傾向[27]。

2.6 MMP- 7(matrilysin、pump- 1)

定位于11q21- q22，負(fù)責(zé)正常情況下細(xì)胞外基質(zhì)重塑及病理性的基底膜及基質(zhì)的破壞。研究表明，攜帶有MMP- 7轉(zhuǎn)導(dǎo)子的細(xì)胞在SCID小鼠體內(nèi)更加具備向肌層侵襲及向肝臟轉(zhuǎn)移的能力，轉(zhuǎn)移灶中MMP- 7前體蛋白(pro- MMP7)表達(dá)高于正常肝組織[28]。有研究指出，入院時(shí)診斷有肝轉(zhuǎn)移患者的MMP- 7陽(yáng)性率(72%)高于5年后發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的患者(47%)，所有轉(zhuǎn)移組患者原發(fā)灶MMP- 7的表達(dá)明顯高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移組的患者，并且這種轉(zhuǎn)移以淋巴循環(huán)途徑居多[29]。新近研究指出，患者血清中MMP- 7水平與患者年齡、腫瘤直徑及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)[30]。

2.7 PRL- 3(PTP4A3)

定位于8q24.3，編碼一種位于細(xì)胞膜表面的酪氨酸磷酸酶，22kD。Saha等應(yīng)用人基因表達(dá)系列分析(SAGE)首次證實(shí)，PRL編碼的蛋白高表達(dá)于結(jié)直腸癌的肝轉(zhuǎn)移灶，而幾乎不表達(dá)于正常大腸上皮細(xì)胞表面，弱表達(dá)于腺瘤以及原發(fā)灶組織中[31]。Bardelli等擴(kuò)大了轉(zhuǎn)移灶的檢測(cè)范圍，發(fā)現(xiàn)PRL- 3只高表達(dá)于結(jié)直腸癌的大部分轉(zhuǎn)移灶(肝、肺、腦、淋巴結(jié))，而不在其他癌癥的肝轉(zhuǎn)移灶和原發(fā)灶中高表達(dá)，且這種高表達(dá)不源于基因的擴(kuò)增[32]。Kato等證實(shí)PRL- 3基因在結(jié)直腸癌細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移的過(guò)程中所扮演的角色是增強(qiáng)細(xì)胞的活動(dòng)性，敲除該基因后細(xì)胞的活動(dòng)性及在肝臟形成的克隆明顯減少[33]。也有報(bào)道認(rèn)為它不僅能破壞原血管的基底層有助于腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散，并能在轉(zhuǎn)移灶有助于異常新血管的生成[34]。

2.8 NDRG1

NDRG1(cap43/rit42/RTP/Drg1/TDD5)是第一個(gè)被證實(shí)的轉(zhuǎn)移抑制因子，位于8q24.2，NDRG1的過(guò)度表達(dá)能夠明顯抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，當(dāng)給無(wú)胸腺的小鼠注入過(guò)量表達(dá)NDRG1的細(xì)胞系SW620后發(fā)現(xiàn)，只有23%的小鼠發(fā)生了肝轉(zhuǎn)移而對(duì)照組有75%發(fā)生了肝轉(zhuǎn)移[35]。SW480和SW620是來(lái)源于同一患者但轉(zhuǎn)移能力不同的兩株細(xì)胞系(SW620轉(zhuǎn)移能力強(qiáng))，當(dāng)SW480細(xì)胞中的NDRG1基因被干擾后，其表型及轉(zhuǎn)移能力均向SW620接近[36]。

2.9 C- Met

定位于7q21- 31，編碼一種跨膜糖蛋白，與肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子/擴(kuò)散因子(HGF/SF)結(jié)合[37]，可使細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂及抗凋亡程序[38]。C-Met編碼的蛋白在血管重塑、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性能提高、生長(zhǎng)、侵襲、分化、遷移發(fā)揮作用[38- 40]。Zeng等用PCR- LDR/FISH的方法發(fā)現(xiàn)，C- Met基因拷貝數(shù)目的增加在結(jié)直腸癌的原發(fā)灶中是一件小概率事件(9/247)，但原發(fā)灶中C- Met基因拷貝數(shù)目增加的患者發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的概率較高(6/9)，同時(shí)這類患者腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)程度較深[41]。

2.10 CCR(chemokine receptor)

在Ghadjar等的研究中發(fā)現(xiàn)，CCR6在原發(fā)灶組織中表達(dá)雖不盡相同，但高表達(dá)CCR6的患者發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的概率(9/11)要遠(yuǎn)高于低表達(dá)CCR6的患者(2/21)，在多重回歸分析中控制性別、年齡、病理分級(jí)等相關(guān)因素后，原發(fā)灶中CCR6的高表達(dá)可以作為預(yù)測(cè)肝轉(zhuǎn)移的獨(dú)立因子[42]，該基因定位于6q27。

3 血清中與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移相關(guān)的指標(biāo)

3.1 miRNA

miRNA是長(zhǎng)度為18～22的非編碼核糖核苷酸片段，通過(guò)干擾轉(zhuǎn)錄或抑制翻譯過(guò)程來(lái)調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)[43]。盡管miRNAs的數(shù)目在不斷增加，但是只有少數(shù)miRNA具有原癌或抑癌基因的作用，并參與腫瘤的發(fā)病機(jī)制[44]。Cheng等用qPCR的方法在中國(guó)的Ⅰ～Ⅲ期結(jié)直腸癌患者中發(fā)現(xiàn)，血漿中高濃度的miR- 141與結(jié)直腸癌患者的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)[45]。Wang等用qPCR方法發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者外周血中miR- 29a含量高于未發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的患者，該標(biāo)志物對(duì)于區(qū)分肝轉(zhuǎn)移的敏感性達(dá)到75%[46]。

3.2 REG- Ⅳ

REG- Ⅳ定位于1p13.1- p12，編碼的REG- Ⅳ屬于鈣依賴性凝集素超家族成員及EGFR/Akt/激活蛋白- 1信號(hào)通路的有效激活劑。用qPCR的方法證實(shí)，大于70%的結(jié)直腸癌患者體內(nèi)均顯示REG- Ⅳ表達(dá)上調(diào)[47- 48]。Oue等用免疫組化的方法發(fā)現(xiàn)，發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者REG- Ⅳ表達(dá)明顯高于未發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的患者，隨后ELISA的方法證實(shí)肝轉(zhuǎn)移患者血清中REG- Ⅳ高于無(wú)肝轉(zhuǎn)移的患者[49]。

上述可在血清中檢測(cè)的新型指標(biāo)還需要更多更大的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)及臨床實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證才能推廣到臨床,目前在臨床應(yīng)用的廣譜血清指標(biāo)為CEA，雖然它能夠提示腫瘤的發(fā)生，但是缺乏足夠的及時(shí)性與敏感性。

4 基因突變

結(jié)直腸癌中最常見(jiàn)的體細(xì)胞突變位于PI3K/RAS- RAF信號(hào)通路中，通過(guò)PIK3CA、KRAS和BRAF基因的突變使得該通路達(dá)到過(guò)度活化的狀態(tài)。這些突變的頻率和熱點(diǎn)在西方結(jié)直腸癌患者中已經(jīng)明確，更多的研究?jī)A向于它們的狀態(tài)與患者對(duì)靶向治療藥物的敏感性及患者預(yù)后的研究。它們與肝轉(zhuǎn)移發(fā)生的負(fù)相關(guān)性只在Bruin 等的研究中被報(bào)道，顯示攜帶有20q擴(kuò)增且無(wú)突變患者肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率高達(dá)61%，是其他患者肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率的3倍。因此，他們認(rèn)為聯(lián)合檢測(cè)結(jié)直腸癌原發(fā)灶中20q擴(kuò)增和PI3K信號(hào)通路基因突變可以很好地預(yù)測(cè)患者手術(shù)后發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)[50]。與此觀點(diǎn)類似，新近有研究認(rèn)為RAS基因突變能夠預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生，但不能預(yù)測(cè)肝轉(zhuǎn)移，肝轉(zhuǎn)移患者中KRAS基因的突變頻率低于其在結(jié)直腸癌患者中普遍公認(rèn)的頻率30%～40%，這從側(cè)面說(shuō)明了KRAS突變與肝轉(zhuǎn)移的負(fù)相關(guān)性[51]。

5 表觀遺傳學(xué)指標(biāo)

正如基因突變的發(fā)生，表觀遺傳學(xué)指標(biāo)的改變也能推進(jìn)結(jié)直腸癌病程的發(fā)展，在結(jié)直腸癌中研究得最為廣泛的是DNA的異常甲基化，約有20%的結(jié)直腸癌患者表現(xiàn)為CIMP表型[52]。結(jié)直腸癌進(jìn)程中常見(jiàn)的甲基化基因已被歸納總結(jié)[53]。Ju等用焦磷酸測(cè)序方法在53例Ⅰ～Ⅲ期、25例Ⅳ期及62例肝轉(zhuǎn)移患者中發(fā)現(xiàn)，超過(guò)80%Ⅳ期及肝轉(zhuǎn)移患者攜帶MGMT甲基化，部分肝轉(zhuǎn)移患者攜帶TIMP3甲基化。CIMP陽(yáng)性的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)及肝轉(zhuǎn)移的時(shí)間要早于CIMP陰性的患者，TIMP3甲基化在肝轉(zhuǎn)移組出現(xiàn)的頻率(15.5%)明顯高于Ⅰ～Ⅲ(3.8%)及Ⅳ期(0%)非肝轉(zhuǎn)移患者。接下來(lái)作者利用MCAM發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)基因在原發(fā)灶和肝轉(zhuǎn)移灶中甲基化狀態(tài)一致，而UPK3A只在轉(zhuǎn)移灶中表現(xiàn)為甲基化狀態(tài)，作者認(rèn)為在原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶表達(dá)不一致的基因才有可能在轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮作用，所以該基因很有可能參與了肝轉(zhuǎn)移的過(guò)程[54]。

綜上所述，結(jié)直腸癌的肝轉(zhuǎn)移是一個(gè)極為復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，涉及到了多種遺傳學(xué)及表觀遺傳學(xué)特征的改變，迄今還沒(méi)有完善的評(píng)估指標(biāo)。并且上述提及的預(yù)測(cè)模型只在西方患者中適用，國(guó)內(nèi)尚無(wú)相關(guān)報(bào)道，但研究者們已經(jīng)注意到了結(jié)直腸癌患者中染色體變異情況的普遍性，且20q的擴(kuò)增是最常見(jiàn)的染色體變異之一[55- 57]。在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移這個(gè)多維化的變化過(guò)程中， 我們希望從不同的角度、不同的分子水平來(lái)找到更多與此過(guò)程相關(guān)的信息，最終將這樣的信息轉(zhuǎn)化為臨床檢測(cè)手段，來(lái)為結(jié)直腸癌患者提供更多的治療指導(dǎo)。

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