(徐州工程學(xué)院食品(生物)工程學(xué)院，江蘇徐州 221000)

酸棗仁為鼠李科植物酸棗(Zizyphusjujubavar.sapinosa)的干燥成熟種子，為衛(wèi)生部認(rèn)定的藥食同源的物品之一。酸棗仁營(yíng)養(yǎng)成分豐富，富含脂肪酸、蛋白、碳水化合物等營(yíng)養(yǎng)素，其中蛋白含量約占36%，蛋白中含人體所需的17種氨基酸[1]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)酸棗仁的研究主要集中于生物堿[2-3]、皂苷[4]和黃酮[5]等化學(xué)成分及藥理功能上，對(duì)于酸棗仁蛋白的研究極少，而有關(guān)利用酸棗仁蛋白酶解制備抗氧化肽工藝的研究未見(jiàn)報(bào)道。通過(guò)蛋白質(zhì)的可控酶解技術(shù)制備抗氧化肽，是蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)中最有前途的抗氧化物質(zhì)[6]。利用酶解技術(shù)生產(chǎn)抗氧化肽的研究已引起了人們的廣泛關(guān)注，有關(guān)大豆[7]、玉米[8]、小麥[9]等蛋白來(lái)源的抗氧化肽已有較多報(bào)道。蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化活性受到酶解pH、溫度、底物濃度、酶與底物濃度比、時(shí)間等因素的影響，因此需要對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化。本課題以酸棗仁為原料，對(duì)Alcalase蛋白酶酶解酸棗仁蛋白制備抗氧化肽的工藝進(jìn)行研究，旨在為高活性酸棗仁抗氧化肽的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸棗仁 安徽亳州藥材市場(chǎng)；Alcalase蛋白酶 丹麥NovoNordisk公司惠贈(zèng)；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) Sigma公司；其它試劑為分析純。

723G分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；PHS-2C精密酸度計(jì) 上海精科雷磁儀器廠；FA2104N電子分析天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；HH-4恒溫水浴鍋 河南智成科技發(fā)展有限公司；FFC-23型萬(wàn)能粉碎機(jī) 江陰萬(wàn)通藥化機(jī)械設(shè)備廠；TGL-16-B高速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;R201L旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申生科技有限公司；TGL-20M高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀 日本日立公司。

1.2 酸棗仁蛋白的制備

將粉碎好的酸棗仁粉置于3倍體積(m/V)的石油醚中，于38℃恒溫水浴攪拌30min，室溫3000r/min離心10min去除溶劑。重復(fù)3次，基本除去酸棗仁粉中的油脂，過(guò)40目篩，得到均一的脫脂酸棗仁粉。稱(chēng)取100g脫脂酸棗仁粉，以一定比例的蒸餾水溶解(液料比24∶1)，調(diào)節(jié)pH11，在57℃下攪拌浸提46min。離心(3000r/min、20min)得上清液，調(diào)節(jié)pH至酸棗仁蛋白的等電點(diǎn)pH4.0，于4℃靜置2h，得到蛋白沉淀。重新懸浮沉淀，調(diào)節(jié)pH至7.0，4℃透析48h脫鹽。脫鹽后的蛋白溶液冷凍干燥后得酸棗仁蛋白。

1.3 酸棗仁蛋白的酶解工藝

稱(chēng)取適量酸棗仁蛋白溶于30mL去離子水中，用0.5mol/L的NaOH溶液調(diào)酶解pH，混勻。將所得溶液放置入恒溫水浴鍋中，緩慢攪拌的同時(shí)加入適量Alcalase 堿性蛋白酶，通過(guò)滴加0.5mol/L的NaOH溶液來(lái)維持pH不變。到所需反應(yīng)時(shí)間后將酶解液置于沸水中滅酶10min，抽濾，濃縮，冷凍干燥得酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物，酶解產(chǎn)物溶于一定量蒸餾水后測(cè)量DPPH自由基清除率。

1.4 DPPH自由基清除率測(cè)定

參照Oyaizu[10]報(bào)道的方法，稱(chēng)取適量酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物溶于1.5mL的去離子水中，振蕩使其充分溶解，再加入1.5mL含0.1mmol/L DPPH·的95%乙醇，混合、振蕩，在室溫下避光放置30min，然后在波長(zhǎng)517nm處檢測(cè)吸光度。

清除率計(jì)算公式如下：

清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100

式中：Ac-為對(duì)照組吸光值，1.5mL蒸餾水加1.5mL含0.1mmol/L DPPH·的95%乙醇；Ai-為樣品組吸光值，1.5mL樣品液加1.5mL含0.1mmol/L DPPH·的95%乙醇；Aj-為空白組吸光值，1.5mL樣品液加1.5mL 95%乙醇。

1.5 單因素試驗(yàn)

考察酶解溫度、底物濃度、酶與底物濃度比([E]/[S])、pH、酶解時(shí)間對(duì)DPPH·清除率的影響。

酶解溫度考察的水平分別為40、45、50、55、60℃，其他酶解條件底物濃度、[E]/[S]、pH、時(shí)間分別為3%、2%、8.0、30min。

底物濃度考察的水平分別為1%、2%、3%、4%、5%，其他酶解條件溫度、[E]/[S]、pH、時(shí)間分別為50℃、2%、8.0、30min。

[E]/[S]考察的水平分別為1%、2%、3%、4%、5%，其他酶解條件溫度、底物濃度、pH、時(shí)間分別為50℃、3%、8.0、30min。

酶解pH考察的水平分別為7、7.5、8、8.5、9，其他酶解條件溫度、底物濃度、[E]/[S]、時(shí)間分別為50℃、3%、2%、30min。

酶解時(shí)間考察的水平分別為20、30、40、50、60min，其他酶解條件為溫度、底物濃度、[E]/[S]、pH分別為50℃、3%、2%、8.0。

1.6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定酶與底物濃度比4%，酶解時(shí)間40min。采取Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以酶解溫度(x1)、pH(x2)和底物濃度(x3)為自變量，以DPPH自由基清除率為響應(yīng)值，安排三因素三水平試驗(yàn)，各個(gè)因素水平編碼值見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平編碼表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments

1.7 酶解產(chǎn)物氨基酸組成的分析

酸水解法(6mol/L HCl于110℃水解24h)分析酶解產(chǎn)物的氨基酸組成[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 酶解溫度對(duì)酸棗仁蛋白酶解物清除DPPH自由基的影響 酶解溫度對(duì)酸棗仁蛋白酶解物清除DPPH自由基的影響見(jiàn)圖1，清除率隨酶解溫度的增加先升高后降低，在酶解溫度為50℃時(shí)，酶活最高，酶解物得率較高，清除率相對(duì)較高，溫度大于50℃后，酶解產(chǎn)物清除DPPH自由基的能力下降，可能的原因是酶活受到抑制，酶解產(chǎn)物得率急劇下降，故選擇較優(yōu)酶解溫度為50℃。

圖1 酶解溫度對(duì)酸棗仁蛋白酶解物清除 DPPH自由基的影響 Fig.1 Effect of temperature on the DPPH scavenging rate of enzymatic hydrolysate of Zizyphi Spinosi Semen protein

2.1.2 底物濃度對(duì)酸棗仁蛋白酶解物清除DPPH自由基的影響 不同底物濃度下的清除率見(jiàn)圖2，清除率隨著底物濃度的增加而增加，而當(dāng)?shù)孜餄舛瘸^(guò)4%時(shí)，DPPH自由基清除率增幅緩慢，這是因?yàn)榈孜餄舛纫堰^(guò)量，考慮到生產(chǎn)成本，故確定底物濃度為4%。

圖2 底物濃度對(duì)酸棗仁蛋白酶解物清除 DPPH自由基的影響 Fig.2 Effect of substrate concentration on the DPPH scavenging rate of enzymatic hydrolysate of Zizyphi Spinosi Semen protein

2.1.3 酶與底物濃度比([E]/[S])對(duì)酸棗仁蛋白酶解物清除DPPH自由基的影響 酶與底物濃度比([E]/[S])對(duì)酸棗仁蛋白酶解物清除DPPH自由基的影響如圖3所示，清除率隨著[E]/[S]的增加而增加，[E]/[S]為4%和5%下的清除率基本保持一致。其原因是在底物過(guò)飽和時(shí)，增加酶量可以提高酶與底物的結(jié)合，從而加快酶促反應(yīng)速率，當(dāng)酶量增加到一定值后，酶分子趨向飽和，此時(shí)繼續(xù)增大酶量對(duì)反應(yīng)速率貢獻(xiàn)不大[11]。故確定[E]/[S]為4%。

圖3 酶與底物濃度比([E]/[S]) 對(duì)酸棗仁蛋白酶解物清除DPPH自由基的影響 Fig.3 Effect of [E]/[S] on the DPPH scavenging rate of enzymatic hydrolysate of Zizyphi Spinosi Semen protein

2.1.4 pH對(duì)酸棗仁蛋白酶解物清除DPPH自由基的影響 圖4為pH對(duì)酸棗仁蛋白酶解物清除DPPH自由基的影響。清除率隨pH的增加呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)pH為8.0時(shí)，酶活最高，得到的酶解產(chǎn)物最高，清除率最高，故選較優(yōu)pH為8.0。

圖4 pH對(duì)酸棗仁蛋白酶解物清除DPPH自由基的影響 Fig.4 Effect of pH on the DPPH scavenging rate of enzymatic hydrolysate of Zizyphi Spinosi Semen protein

2.1.5 酶解時(shí)間對(duì)酸棗仁蛋白酶解物清除DPPH自由基的影響 圖5為酶解時(shí)間對(duì)清除率的影響，清除率隨酶解時(shí)間的增加逐漸升高，酶解時(shí)間在20～40min之間，清除率顯著增加，當(dāng)超過(guò)40min后，底物幾乎完全被酶解，清除率趨于平緩，故確定酶解時(shí)間為40min。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)酸棗仁蛋白酶解物清除 DPPH自由基的影響 Fig.5 Effect of time on the DPPH scavenging rate of enzymatic hydrolysate of Zizyphi Spinosi Semen protein

2.2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定[E]/[S]為4%，酶解時(shí)間為40min，選取酶解溫度、pH、底物濃度三個(gè)因素安排Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果如表2所示。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of experiments

2.2.1 回歸模型的建立與檢驗(yàn) 對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)用多元回歸擬合后，得到清除率(Y)與酶解溫度(x1)、pH(x2)和底物濃度(x3)的回歸方程：

Y=-3175.392+34.293x1+596.521x2-7.402x3-1.317x1x2+0.452x1x3+0.435x2x3-0.252x12-32.916x22-4.047x32

對(duì)該回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance with regression model

對(duì)表3回歸模型系數(shù)的顯著性分析可見(jiàn)，一次項(xiàng)中，x2、x3極顯著(p<0.01)，x1達(dá)到顯著水平(p<0.05)；平方項(xiàng)的回歸系數(shù)均極顯著，說(shuō)明各因素與清除率之間存在明顯的二次關(guān)系；二次項(xiàng)中x1x2的回歸系數(shù)均達(dá)到極顯著水平(p<0.01)，x1x3的達(dá)到顯著水平(p<0.05)，表明酶解溫度和pH、酶解溫度和底物濃度之間的交互作用對(duì)酶解產(chǎn)物的清除率有顯著影響。

2.2.2 兩因素間的交互效應(yīng)分析 固定一個(gè)因素在零水平上，研究另兩個(gè)因素間的交互效應(yīng)。

固定底物濃度于零水平時(shí)，繪出酶解溫度和pH的交互效應(yīng)的響應(yīng)面，如圖6a清除率隨酶解溫度和pH的變化會(huì)產(chǎn)生較大變化，隨著酶解溫度和pH的增加，清除率明顯呈現(xiàn)出先增后減的趨勢(shì)。若要獲得較高的清除率，酶解溫度應(yīng)該在50.0～52.5℃之間，pH應(yīng)該在8.0～8.3之間。在不同的酶解溫度水平下，隨著pH的增大，清除率變化的程度不同；在不同的pH水平下，隨著酶解溫度的增加，清除率變化的程度亦不同。

圖6b為酶解溫度和底物濃度的交互效應(yīng)的響應(yīng)面。若要獲得較高的清除率，酶解溫度應(yīng)該在50.0～52.5℃之間，底物濃度應(yīng)該在4.5%～5.0%之間，底物濃度對(duì)清除率的影響較酶解溫度更為敏感。

圖6 試驗(yàn)因素交互作用對(duì)酸棗仁蛋白酶解物清除 DPPH自由基的影響 Fig.6 Interactive effect of three factors on the DPPH scavenging rate of enzymatic hydrolysate of Zizyphi Spinosi Semen protein

2.2.3 最佳條件優(yōu)化及驗(yàn)證結(jié)果 通過(guò)所得回歸模型對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳提取工藝條件為酶解溫度51.2℃、酶解pH8.1、底物濃度4.7%，在此條件下清除率的最大理論值為91.59%。對(duì)此優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證，實(shí)測(cè)清除率為91.54%，與預(yù)測(cè)值基本一致，表明該回歸模型具有較好的預(yù)測(cè)性能，可用于指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐。

2.3 酶解產(chǎn)物氨基酸組成分析

酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物的氨基酸組成見(jiàn)表4，由表4可知，酶解產(chǎn)物共含有17種氨基酸，其中富含脯氨酸、甘氨酸和谷氨酸，蛋氨酸含量較低，脯氨酸和甘氨酸殘基能表現(xiàn)出較好的抗氧化性[12]。此外，總疏水基氨基酸的含量高達(dá)48.440%，而總疏水基氨基酸的含量與抗氧化能力呈正相關(guān)性[13]。

表4 酶解產(chǎn)物氨基酸組成Table 4 Amino acid composition analysis of enzymatic hydrolysate

3 結(jié)論

以DPPH自由基清除率作為指標(biāo)評(píng)價(jià)了酸棗仁蛋白酶解物的抗氧化活性，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定[E]/[S]為4%，酶解時(shí)間為40min后，通過(guò)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)建立了DPPH自由基清除率與酶解溫度、酶解pH和底物濃度的二次多項(xiàng)式模型，最佳制備工藝參數(shù)為酶解溫度51.2℃、酶解pH8.1、底物濃度4.7%，在此條件下清除率的最大理論值為91.59%。此模型在試驗(yàn)范圍內(nèi)能較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)酸棗仁蛋白酶解物對(duì)DPPH自由基的清除率。酸棗仁蛋白酶解產(chǎn)物富含脯氨酸、甘氨酸和谷氨酸。

[1]李續(xù)娥,李維鳳,裴渭靜. 酸棗仁與緬棗仁的蛋白質(zhì)分析[J]. 中草藥,2002,33(1):26-28.

[2]Ma Y,Han H,Eun J S,etal. Sanjoinine A isolated from Zizyphi Spinosi Semen augments pentobarbital-induced sleeping behaviors through the modification of GABA-ergic systems[J]. Biol Pharm Bull,2007,30(9):1748-1753.

[3]Yoon S R,Jo Y J,Yang S,etal. Sanjoinine A isolated from Semen Zizyphi Spinosi protects against kainic acid-induced convulsions[J]. Arch Pharm Res,2009,32(11):1515-1523.

[4]Matsuda H,Murakami T,Ikebata A,etal. Bioactive saponins and glycosides. XIV. Structure elucidation and immunological adjuvant activity of novel protojujubogenin type triterpene bisdesmosides,protojujubosides A,B,and B1,from the seeds of Zizyphus jujuba var. spinosa(Zizyphi Spinosi Semen)[J]. Chem Pharm Bull,1999,47(12):1744-1748.

[5]丁軻,谷禹,陸晶晶,等. 酸棗仁黃酮組分提取純化工藝的研究[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào),2011,11(4):62-70.

[6]張君慧,張暉,王興國(guó),等. 抗氧化活性肽的研究進(jìn)展[J] . 中國(guó)糧油學(xué)報(bào),2008,23(6):228-231.

[7]陳美珍,余杰,郭慧敏. 大豆分離蛋白酶解物清除自由基作用研究[J]. 食品科學(xué),2002,23(1):43-47.

[8]張強(qiáng),闞國(guó)仕,陳紅漫. 酶解玉米蛋白粉制備抗氧化肽[J].食品工業(yè)科技,2005,26(6):109-111.

[9]Wang J S,Zhao M M,Zhao Q Z,etal. Antioxidant properties of papain hydrolysates of wheat gluten in different oxidation systems[J]. Food Chemistry,2007,101(4):1658-1663.

[10]Oyaizu M. Studies on products of browning reactions antioxidative activities of products of browning reaction prepared from glucosamine [J]. Japanese Joumal of Nutrition,1986,44:307-315.

[11]康瑋麗,唐軍虎,敬思群. 酶解核桃蛋白制備抗氧化肽工藝條件優(yōu)化[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2010,36(12):94-99.

[12]Rajapakse N,Mendis E,Byun H G,etal. Purification andinvitroantioxidative effects of giant squid muscle peptides on free radical-mediated oxidative systems[J]. J Nutr Biochem,2005,16(9):562-569.

[13]CHEN H M,Muramoto K,Yamauchi F,etal. Antioxidant activity of designed peptides based on the antioxidative peptide isolated from digests of a soybean protein[J]. J Agric Food Chem,1996,44(9):2619-2623.