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(西南大學食品科學學院,重慶 400715)

花椒別名為川椒、紅椒、蜀椒、大紅袍。它具有溫中散寒、殺蟲、祛濕、止痛等功能?；ń分械闹饕瘜W成分有揮發(fā)油、生物堿、酰氨、木脂素、香豆素、黃酮類物質(zhì)、脂肪酸[1-2]等,其它成分還有二萜、甾醇、烴類和黃酮甙類[3]等?；ń仿槲端厥腔ń分兄匾幕钚猿煞?是花椒呈麻味的主要成分,花椒麻味素在花椒中大多以鏈狀不飽和脂肪酸酰胺的形式存在,在其他物質(zhì)中則以帶芳環(huán)的酰胺形式存在[4],所以又稱花椒酰胺?；ń返穆槲冻煞植粌H具有麻醉、興奮、抑菌、祛風除濕、殺蟲和鎮(zhèn)痛等功效,同時還具有抗血小板凝集、松弛胃體的環(huán)形肌和回腸縱向肌等有益健康的功能[5]。

腸道健康與人體健康關系密切,腸道健康又與腸道微生物緊密聯(lián)系。正常人體大腸中含有約1013～1014個微生物,它們對維持腸道正常的生理功能具有重要作用。腸道微生物每天消耗約60～80g進入大腸的多糖、低聚糖、蛋白質(zhì)、肽和糖蛋白等未消化殘渣。糖類底物在腸道中發(fā)酵會產(chǎn)生短鏈脂肪酸(SCFAs)和氣體(CO2,CH4,H2),SCFAs主要是乙酸、丙酸、丁酸,其次還有異丁酸[6]。含氮底物化合物發(fā)酵則產(chǎn)生游離氨、苯酚等有害產(chǎn)物。

目前國內(nèi)外對花椒麻味素的研究集中于花椒的麻醉效果,而花椒麻味素對腸道健康的研究較少。本實驗室前期研究了花椒精對腸道健康的影響,結果表明花椒精能促進腸道發(fā)酵,有益腸道健康。因為花椒精中含有32.18%的花椒麻味素,所以本實驗進一步研究了花椒麻味素對腸道健康的影響情況。預測在食品,醫(yī)藥等方面會被廣泛應用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SD雌性大鼠 動物許可證號:SCXK(渝)20070008,體重90～110g,40只,百森生物技術公司;花椒麻味素 實驗室提取,純度為95.7%;基礎飼料 百森生物技術公司;巴豆酸(色譜級) 日本東京天成工業(yè)株式會社;氫氧化鈉、苯酚、次氯酸鈉、鎢酸鈉、硫酸 分析純,成都市科龍化工試劑廠;乙酸(色譜級) 英國Johnson Matthey公司;丙酸(色譜級)、丁酸(色譜級)、異丁酸(色譜級) 梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;亞硝基鐵氰化鈉(分析純) 天津市光復精細化工研究所。

GC-2010高效氣相色譜儀 日本島津公司;pH計H18424 意大利HANNA公司;Spectrumlab 22可見光分光光度計 上海棱光技術有限公司;千分之一天平HZT-300-A 福州華志科學儀器公司。

1.2 動物飼養(yǎng)與樣品采集

將購買的4周齡SD雌性大鼠40只放入不銹鋼鼠籠中,每籠飼養(yǎng)1只大鼠,室溫保持在(25±1)℃,12h明暗輪換(9:00～21:00)。喂食基礎飼料(表1)一周使大鼠適應喂養(yǎng)環(huán)境后,按大鼠體重隨機將大鼠分為空白組(LOD)、高脂組即高脂空白組(HF-LOD)、高脂并灌胃4mg/kg(HF-CD)、高脂并灌胃8mg/kg(HF-MD)、高脂并灌胃12mg/kg(HF-HD)花椒麻味素的大豆油溶液等共5組各8只。高脂組每天喂食高脂飼料并且每天15:00對高脂組灌喂花椒麻味素,花椒麻味素需溶于大豆油中配成溶液。灌胃劑量均為每100g體重0.1mL。所有實驗大鼠實驗期間自由攝食和飲水,每3d稱量一次大鼠體重,同時需調(diào)整灌喂量,每天記錄大鼠采食量。喂養(yǎng)4周后解剖,測定各批盲腸內(nèi)容物重量、盲腸壁面積、游離氨、pH和短鏈脂肪酸(short-chain fatty acid,SCFAS)和微生物。

1.3 檢測指標與方法

1.3.1 SCFAS測定 將預處理的盲腸內(nèi)容物樣品在4000r/min轉(zhuǎn)速下離心15min,吸取上清液轉(zhuǎn)移至預處理10mL離心管中,10000r/min轉(zhuǎn)速下繼續(xù)離心15min,1mL一次性注射器吸取上清液1mL,0.25μm濾膜過濾至2mL進樣小瓶中待測[7]。

表1 基礎飼料配方Table 1 Composition of the basic diet

氣相色譜條件:進樣量1μL;進樣口溫度220℃;柱流量0.95mL/min,柱溫90℃、平衡時間0.5min,5℃/min升溫至150℃,保留時間7min;檢測器溫度230℃;氫氣流量40mL/min,空氣流量400mL/min,尾吹流量40mL/min[8]。

1.3.2 pH測定 電位法。

稱取一定質(zhì)量的新鮮糞便/盲腸內(nèi)容物于10mL去離子水預處理離心管中,加入10倍(V∶m)去離子水,旋渦混合儀上混勻后靜置,測上清液pH。

1.3.3 盲腸內(nèi)容物及腸壁重量 稱重法。

1.3.4 游離氨含量測定 比色法。

無氨水制備[9]:在1000mL蒸餾水中加入0.10mL硫酸(ρ=1.84g/mL),并在全玻璃蒸餾器中重蒸餾,棄去前50mL蒸出液,然后將蒸出液收集在帶有玻璃塞的玻璃瓶中。

將預處理的盲腸內(nèi)容物樣品4000r/min下離心5min,吸取上清液1mL,依次加入1mL含有0.001mol/L亞硝基鐵氰化鈉的0.5mol/L苯酚溶液和1mL含有0.03mol/L次氯酸鈉的0.625mol/L氫氧化鈉溶液,60℃保溫5min,625nm波長下測吸光度[10]。

1.3.5 盲腸壁面積測定 首先用冰冷生理鹽水洗凈盲腸,充分展開后固定在A4紙上,勾出其輪廓,待紙干燥后將盲腸壁輪廓復寫在厚的打印紙上,然后將紙上的盲腸輪廓圖剪下。用精密度為0.0001g的電子秤準確稱量輪廓圖紙質(zhì)量(m2)和1cm2的打印紙質(zhì)量(m1),然后按以下公式計算盲腸表面積(cm2)。

1.3.6 盲腸內(nèi)容物菌群測定 取新鮮的盲腸內(nèi)容物0.2g左右,加入10倍(V/m)無菌生理鹽水,旋渦混合儀振蕩混勻,制得10-1稀釋度盲腸內(nèi)容物。依次10倍稀釋至10-8稀釋度,選擇10-1、10-2、10-3三個稀釋度,用于大腸桿菌和腸球菌的培養(yǎng)計數(shù);選擇10-4、10-5、10-6三個稀釋度,用于雙歧桿菌和乳酸桿菌的培養(yǎng)計數(shù),選擇10-2、10-3、10-4三個稀釋度,用于厭氧菌的培養(yǎng)計數(shù),接種量為200μL。

表3 花椒麻味素對SD雌性大鼠盲腸壁濕重與盲腸總重之比、盲腸面積、游離氨和pH的影響Table 3 Effects of dietary sanshool on wall wet weight Wet weight and total weight of the wall,wall area,free ammonia and pH in female Sprague-Dawley rats

表4 花椒麻味素對SD雌性大鼠盲腸內(nèi)容物中短鏈脂肪酸的影響Table 4 Effects of dietary sanshool on SCFAS in female Sprague-Dawley rats

雙歧桿菌于BLL培養(yǎng)基37℃、48h厭氧培養(yǎng)。乳桿菌于MRS培養(yǎng)基37℃、48h培養(yǎng)。腸桿菌于伊紅美藍培養(yǎng)基37℃、24h培養(yǎng)。腸球菌于疊氮鈉-結晶紫-七味苷培養(yǎng)基37℃、48h培養(yǎng)。厭氧菌于靛基質(zhì)培養(yǎng)基37℃、48h培養(yǎng)。結果均以lg(CFU/g)表示。

1.4 統(tǒng)計分析

實驗結果以mean ± SD表示,各組間顯著性差異采用SPSS分析,p<0.05被認為有顯著差異。

2 結果與分析

2.1 花椒麻味素對SD雌性大鼠采食量、體重增加量及飼料效率的影響

由表2可以看出,高脂空白組與空白組相比,體重增加量增加了,采食量卻顯著降低(p<0.05),飼料效率顯著增加(p<0.05)。說明高脂膳食能促進SD大鼠體重增加,同時能明顯降低食欲從而減少飼料的攝入及能夠提高飼料效率;而高脂空白組與劑量組相比,體重增加量和飼料效率都顯著性增加,說明飼料中的脂肪能降低SD大鼠的食欲,進而減小了飼料的攝入。

表2 花椒麻味素對SD雌性大鼠采食量、 體重增加量及飼料效率的影響Table 2 Effects of dietary sanshool on body weight gain,food intake and feed efficiency in female Sprague-Dawley rats

2.2 花椒麻味素對SD雌性大鼠盲腸壁濕重與盲腸總重之比、盲腸面積、游離氨和pH的影響

由表3可知,高脂空白組與空白組相比,SD大鼠的盲腸面積顯著增加。說明飼料中的脂肪能抑制盲腸組織的縱向生長,促進盲腸的橫向生長;高脂空白組與劑量組相比,盲腸面積顯著增加,低、高劑量組的游離氨含量顯著增加,高劑量組的pH顯著降低。說明花椒麻味素能抑制由脂肪引起的盲腸組織的橫向生長,低、高劑量的花椒麻味素能促進細菌分泌脲酶,進而分解尿總堿產(chǎn)生游離氨,中劑量的花椒麻味素則能促進大腸中能夠利用游離氨合成蛋白質(zhì)的細菌的合成作用。盲腸內(nèi)pH的降低會促進腸道細菌分泌的脲酶的活性,進而促進了尿總堿的分解產(chǎn)生游離氨。

2.3 花椒麻味素對SD雌性大鼠盲腸內(nèi)容物中短鏈脂肪酸的影響

由表4得知,高脂空白組與空白組相比,盲腸內(nèi)容物中各種短鏈脂肪酸的變化不大,說明飼料中的脂肪對盲腸內(nèi)飼料的發(fā)酵影響不大;高脂空白組與劑量組相比,中劑量組的丙酸、異丁酸和總的短鏈脂肪酸都顯著性增加,說明中劑量的花椒麻味素能促進飼料在盲腸中的發(fā)酵進而產(chǎn)生較多的短鏈脂肪酸。

2.4 花椒麻味素對SD雌性大鼠盲腸內(nèi)容物中微生物的影響

由表5可以看出,高脂空白組與空白組相比,盲腸中雙歧桿菌的數(shù)量顯著降低,說明高脂膳食能抑制腸道有益菌的生長;高脂空白組與劑量組相比,中劑量組的腸球菌顯著降低、乳酸菌顯著增加及厭氧菌的數(shù)量顯著增加,中、高劑量組的大腸桿菌顯著降低了,各劑量組的雙歧桿菌顯著增加,說明花椒麻味素能促進腸道有益菌的生長,抑制腸道有害菌的生長,尤其是中劑量組的作用效果最明顯。

表5 花椒麻味素對SD雌性大鼠盲腸內(nèi)容物中微生物的影響Table 5 Effects of dietary sanshool on microorganism in female Sprague-Dawley rats

3 結論與討論

大鼠體重增加量間接反映飼料在胃腸道內(nèi)消化吸收的利用情況,在機體運動量與基本代謝量一致的情況下,灌喂花椒麻味素大鼠的體重增加量增加,說明花椒麻味素能夠促進飼料的消化利用率,使飼料充分轉(zhuǎn)化為能被機體消化吸收的營養(yǎng)物質(zhì)。從采食量來看,高脂空白組及劑量組的飼料攝入量明顯降低,說明脂肪和花椒麻味素都能夠抑制食欲,減少攝食量。

高脂空白組與空白組相比,盲腸壁濕重占總重比值降低,盲腸面積卻顯著增加。說明脂肪抑制盲腸組織的縱向生長,促進盲腸組織的橫向生長。高脂空白組和劑量組相比,盲腸面積顯著減小,說明花椒麻味素能抑制盲腸組織就脂肪引起的橫向生長。

游離氨主要是小腸中谷氨酰胺代謝產(chǎn)生[11],大腸微生物代謝也可以產(chǎn)生[12-14]。腸道內(nèi)游離氨主要是由細菌分泌的脲酶分解尿總堿產(chǎn)生的,一部分游離氨在大腸中被用于細菌蛋白質(zhì)的合成[15]。有研究表明,腸道菌群嚴重失調(diào)(雙歧桿菌下降,大腸桿菌、梭菌大量繁殖),尿總堿合成受阻,會產(chǎn)生更多的氨[16]。高脂空白組與劑量組相比,低、高劑量組的游離氨含量顯著增加,高劑量組的pH顯著降低,說明低、高劑量的花椒麻味素能促進細菌分泌脲酶,進而分解尿總堿產(chǎn)生游離氨,中劑量的花椒麻味素則能促進大腸中能夠利用游離氨合成蛋白質(zhì)的細菌的合成作用。盲腸內(nèi)pH的降低會促進腸道細菌分泌的脲酶的活性,進而促進了尿總堿的分解產(chǎn)生游離氨。

飼料中的抗消化淀粉在腸道經(jīng)厭氧菌發(fā)酵能產(chǎn)生短鏈脂肪酸,主要是乙酸、丙酸、丁酸,其次還有異丁酸[17-18]。SCFAs是大腸通常的生理功能性物質(zhì),具有調(diào)節(jié)腸肌活力、刺激電解液和流體的增加、增加血流及修復DNA損傷等[19-22]。SCFAs不僅為結腸粘膜提供了主要的能量供應,而且還可以維護腸道上皮細胞的完整性和杯狀細胞的分泌功能。對粘膜免疫細胞有維護作用,還可以減少促炎因子的生成,有利于粘膜炎癥的修復。乙酸有增強結腸血供給和氧攝取的作用,丙酸對葡萄糖的異生有一定作用[23],丁酸是腸壁細胞首選的氧化底物,也能抑制腸癌細胞增生和增強脫噬作用[24-25]。SCFAS還可以降低盲腸中pH,進而促進腸健康[26]。高脂空白組與劑量組相比,中劑量組的丙酸、異丁酸和總的短鏈脂肪酸都顯著性增加,說明中劑量的花椒麻味素能促進飼料在盲腸中的發(fā)酵進而產(chǎn)生較多的短鏈脂肪酸。

作為腸道中重要的生理菌群,雙歧桿菌能大量合成動物所需的營養(yǎng)物質(zhì)和維生總堿,對多種腸道病原微生物產(chǎn)生拮抗,調(diào)節(jié)腸道菌群,增強機體免疫力,還能抗腫瘤,抗衰老,抗感染,以及提高人體對放射線的耐受力。低劑量的花椒麻味素就能夠促進盲腸中雙歧桿菌的生長,說明食用花椒麻味素能促進腸道健康。高脂空白組與空白組相比,盲腸中雙歧桿菌的數(shù)量顯著降低,說明高脂膳食能抑制腸道有益菌的生長;高脂空白組與劑量組相比,中劑量組的腸球菌顯著降低、乳酸菌顯著增加及厭氧菌的數(shù)量顯著增加,中、高劑量組的大腸桿菌顯著降低了,各劑量組的雙歧桿菌顯著增加,說明花椒麻味素能促進腸道有益菌的生長,抑制腸道有害菌的生長。

通過本次實驗結果可以知道,短期食用花椒麻味素對機體腸道健康是有益的。但因本實驗時間有限,未能深入研究長期食用花椒麻味素對腸道健康的影響及影響腸道健康的機理,還需進一步研究。

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