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(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730070)

蛋白質(zhì)組學(xué)是指在高通量水平上研究蛋白質(zhì)的特征,包括表達(dá)、翻譯后的修飾、互作等內(nèi)容。所涉及的技術(shù)包括蛋白質(zhì)提取、分離、鑒定以及生物信息學(xué)分析等,其中蛋白質(zhì)的提取是重要的過程[1]。由于水果組織中蛋白含量極低,加之富含蛋白酶及存在大量干擾物質(zhì),為后續(xù)的分析帶來了諸多困難[2-3]。因此,選擇適宜的水果蛋白質(zhì)提取方法對開展蛋白質(zhì)組學(xué)的研究就顯得十分必要。目前,基于蛋白組學(xué)的水果蛋白質(zhì)提取的方法均借鑒于其他植物材料,主要包括四種,分別是酚抽提法、SDS法、裂解液法以及三氯乙酸-丙酮法。本文對這些方法的特點(diǎn)及應(yīng)用兩方面進(jìn)行了綜述,旨在推薦適宜的提取方法,為水果蛋白組學(xué)的研究提供參考。

1 提取方法

1.1 酚抽提法

此法源于Hurkman[4]等人對植物細(xì)胞膜蛋白的提取。操作過程是取冷凍的組織,加入含有Tris-飽和酚和提取緩沖液(蔗糖,Tris-HCl,乙二胺四乙酸(EDTA),KCl,β-巰基乙醇,苯甲基磺酰氟(PMSF))研磨,離心取酚相,剩余液體用Tris-飽和酚繼續(xù)提取、離心收集酚相,加入醋酸銨的丙酮溶液離心,再用醋酸銨的丙酮溶液、丙酮、乙醇分別洗滌沉淀,冷凍干燥沉淀后獲得蛋白。由于該法可以有效地除去鹽離子、酚類、糖類和色素等大量干擾物質(zhì),加之酚是強(qiáng)的蛋白變性劑,可以使蛋白質(zhì)變性析出[5],因此可獲得純度較高的蛋白質(zhì),但該法操作過程較為繁瑣。

酚抽提法現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于水果蛋白質(zhì)的提取[6]。陳虎等[7]利用該法獲得了南豐蜜桔果皮中的蛋白質(zhì),提取率較高,得到的蛋白呈乳白色,易溶解。盧丞文等[8]采用高濃度Tris抑制蛋白酶的活性,采用提取緩沖液(蔗糖,Tris-Hcl,EDTA,KCl,β-巰基乙醇,PMSF)進(jìn)行兩次提取,充分去除干擾物質(zhì),從粉紅果番茄果實(shí)中得到了純度較高的蛋白質(zhì)。Deytieux等[9]對該法進(jìn)行了改良,他們將收集完酚相后的粗蛋白置于醋酸銨-甲醇溶液中,-20℃過夜沉淀,之后再用乙酸銨-甲醇溶液、冷甲醇、冷乙醇分別洗滌,得到了純度較好的葡萄果皮蛋白質(zhì)。Negri等[10]運(yùn)用該法建立了葡萄果實(shí)細(xì)胞壁蛋白的提取方法,蛋白得率較高。

表1 果實(shí)蛋白提取的四種方法的比較Table 1 Comparison of four protein extraction methods of fruit

1.2 三氯乙酸-丙酮法(TCA-丙酮法)

水果蛋白質(zhì)提取的經(jīng)典方法,源于Damerval[11]等對小麥幼苗蛋白的提取。操作過程是取冷凍的組織,加入TCA-丙酮研磨,離心得到蛋白質(zhì)沉淀,用丙酮洗滌沉淀、離心,冷凍干燥沉淀。三氯乙酸和丙酮都是有效的蛋白沉淀劑,兩者通常結(jié)合使用以除去果實(shí)組織中含有的大量的以各種形式存在的可溶性非蛋白干擾物質(zhì),主要包括多酚、萜類和有機(jī)酸等[12]。此法最大的缺點(diǎn)是沉淀不完全會造成蛋白質(zhì)的損失以及沉淀后得到的蛋白質(zhì)難溶于裂解液中,且得到的蛋白質(zhì)純度不高,其中含有較多的雜質(zhì)[13],這些都為后續(xù)的研究帶來困難,故其應(yīng)用受到限制。因此,需在提取過程中加入EDTA和Triton X-100等除鹽劑以及還原劑(二硫蘇糖醇(DTT)、β-巰基乙醇)和蛋白酶抑制劑PMSF等保持蛋白穩(wěn)定性的試劑,然后再用TCA-丙酮沉淀,可以獲得良好的提取效果[14]。

該法較適用于果皮中蛋白質(zhì)的提取。鄧貴明等[15]利用該法提取了柑橘果皮中的蛋白質(zhì),所得蛋白質(zhì)量大且純度高。楊愛珍等[16]用該法對桃果實(shí)硬核后期果皮中的蛋白進(jìn)行了提取,獲得了純度高的蛋白質(zhì)。鐘鳳林[17]利用改良的該法提取了琯溪蜜柚果實(shí)汁胞中的蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)得率較高。王一鳴[18]采用優(yōu)化的該法提取了硬核期桃果皮中的蛋白質(zhì),得到了純度較高的蛋白質(zhì)。Jean[19]等用該法獲得了得率較高的葡萄果皮蛋白質(zhì)。

1.3 SDS法

此法的特點(diǎn)是在提取緩沖液中加入十二烷基磺酸鈉(SDS)。操作過程是取冷凍的組織,加入含有SDS的提取液研磨,離心,加入丙酮形成沉淀,再離心,取沉淀用丙酮洗滌至無色,冷凍干燥沉淀后獲得蛋白。該法往往與酚法或TCA-丙酮法相結(jié)合。經(jīng)SDS優(yōu)化后的酚法和TCA-丙酮法,蛋白質(zhì)的得率及純度明顯提高。由于SDS是一種陰離子去垢劑,因此要通過多次洗滌蛋白沉淀去除[20]。SDS具有很高的蛋白質(zhì)結(jié)合能力,尤其是在高溫條件下(95℃)可提高與膜蛋白的親和力,同時(shí)在細(xì)胞裂解和蛋白提取過程中可抑制酶的活力[21]。

馬斌等[22]在酚抽提法的基礎(chǔ)上,通過在提取液中加入SDS,獲得了得率及純度較高的枇杷果實(shí)蛋白質(zhì)。Wang等[23]結(jié)合TCA-丙酮法和酚法,通過加入了SDS,建立了一種適于多種果實(shí)蛋白提取的方法,得率高,所含雜質(zhì)較少。Song等[24]運(yùn)用TCA-丙酮法、熱SDS緩沖液提取結(jié)合TCA-丙酮沉淀提取了蘋果和香蕉果實(shí)果皮及果肉中的蛋白質(zhì),對于蘋果果皮來說,SDS法的蛋白得率最高,雜質(zhì)最少。

1.4 裂解液法

也稱為尿素-硫脲法,運(yùn)用溶解蛋白質(zhì)沉淀的裂解液直接提取蛋白質(zhì),其主要成分為尿素、硫脲、Tris-HCl、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)、DTT等[25]。操作過程是取冷凍的果實(shí)組織,加入裂解液研磨。靜置后離心,再加入丙酮靜置過夜。次日離心,收集沉淀并用丙酮洗滌至無色,冷凍干燥沉淀。用該方法提取的蛋白質(zhì)雜質(zhì)少,但相對于前幾種方法蛋白質(zhì)得率低,所得的沉淀需反復(fù)洗滌去除裂解液。

鄭誠樂等[26]利用該法提取得到的粗提物含量較高,經(jīng)過沉淀、溶解后蛋白質(zhì)得率高、雜質(zhì)少。Barraclough等[27]利用該法結(jié)合丙酮沉淀提取了蘋果、鱷梨、檸檬和桃等果實(shí)中的蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)得率及純度均較高。

2 四種方法的比較

上述各種方法均有其各自的特點(diǎn)。李開拓等[28]比較了酚法和TCA-丙酮法提取荔枝果皮中總蛋白質(zhì)的效果,酚法得到的蛋白質(zhì)含量較高。金良[29]等認(rèn)為酚法所得葡萄果實(shí)蛋白質(zhì)純度高于TCA-丙酮法。吳滿成等[30]分別用酚法和TCA-丙酮法提取了牛奶子果實(shí)中的蛋白質(zhì),后者的蛋白得率略高于前者,但純度低于前者。王卓等[31]比較了酚抽提法和TCA-丙酮法提取香蕉果實(shí)中總蛋白質(zhì)的提取效果,前者所得蛋白質(zhì)量大且純度高。王清等[6]建立了適用于甜櫻桃、桃、蘋果、芒果和冬棗等多種果實(shí)的蛋白提取方法,用酚抽提法提取的蛋白質(zhì)數(shù)量明顯多于TCA-丙酮法。Saravanan等[32]利用酚法、TCA-丙酮法及改良的TCA-丙酮法提取番茄、鱷梨、香蕉和橙等果實(shí)組織中的蛋白質(zhì),并比較了提取效果,發(fā)現(xiàn)酚法的蛋白得率總體上都高于其他兩種方法,對于鱷梨、香蕉和橙子,TCA-丙酮法和改良的TCA-丙酮法蛋白質(zhì)得率低且雜質(zhì)較多,而酚法效果較好。Vincent等[33]對比了酚法、TCA-丙酮法、SDS法對葡萄果實(shí)蛋白質(zhì)的提取效果,酚法在蛋白得率和2D電泳效果方面都優(yōu)于SDS法和TCA-丙酮法。王海玲[34]等用改良的酚法、SDS法、尿素/硫脲法提取了桑葚中的蛋白質(zhì),無論是純度還是得率均以酚法最好。Isaacson等[35]比較了酚法和TCA-丙酮法,認(rèn)為酚法更適用于復(fù)雜的頑拗植物組織如成熟葡萄果粒、香蕉果實(shí)等的蛋白質(zhì)提取。

3 結(jié)論

綜上所述,四種提取方法各有其優(yōu)劣。由于果實(shí)的種類和品種、部位以及成熟度不同,故在具體操作中還需對酚法的提取過程進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化,如采用高濃度Tris-飽和酚、抑制蛋白酶的活性、增加提取次數(shù)或與其他方法結(jié)合。考慮到目前的提取方法普遍存在蛋白質(zhì)中雜質(zhì)偏多,以及提取液殘留等問題,因此,除雜仍然是提取蛋白質(zhì)中需要細(xì)化的內(nèi)容。同時(shí),還需要開發(fā)簡單、快速而又有效的提取新方法。

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