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(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院 黑龍江省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150076)

硫酸軟骨素(Chondroitin Sulfate,CS)是來(lái)自動(dòng)物喉骨、鼻軟骨、氣管等富含軟骨組織的一類重要酸性高分子黏性多糖[1],具有多種重要生物活性。例如:具有抗炎、抗癌、抗HIV、降血脂、抗凝血活性的功效;能有效預(yù)防關(guān)節(jié)炎[2]、減輕打鼾;還可以改善食物風(fēng)味、口感、光澤及保濕性[3-5]等。鑒于其潛在的醫(yī)藥價(jià)值,2010年《中華人民共和國(guó)藥典》將硫酸軟骨素列為防治心血管疾病和關(guān)節(jié)病的最佳藥物。同時(shí)硫酸軟骨素作為膳食補(bǔ)充劑和保濕劑,廣泛應(yīng)用于食品和化妝品領(lǐng)域[6-7]。本文綜述了硫酸軟骨素的制備及提取純化工藝、檢測(cè)方法、性能研究,并闡述了近些年硫酸軟骨素在各領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀,擬為硫酸軟骨素的進(jìn)一步研究與開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 硫酸軟骨素的制備工藝

1.1 硫酸軟骨素的提取制備方法研究現(xiàn)狀

硫酸軟骨素是由D-葡萄糖醛酸和氨基己糖交替連結(jié)而成的雙糖聚合物。它通常與蛋白質(zhì)結(jié)合成糖蛋白的形式存在,當(dāng)其水解時(shí)發(fā)生β-消去反應(yīng),使得連接硫酸軟骨素與蛋白質(zhì)的O-糖苷鍵的糖-肽鍵斷裂,釋放出游離態(tài)的硫酸軟骨素,而O-糖苷鍵上連接的羥基氨基酸則分別轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酮酸。

目前,國(guó)內(nèi)外硫酸軟骨素的提取多來(lái)自豬軟骨[8]、豬喉骨[9]、雞胸軟骨[10];?；蜓虮枪荹11]、喉骨、軟肋、氣管、月牙骨以及各部位的雜軟骨[12];魚軟骨[13-15]、蛋殼膜[16]等。硫酸軟骨素主要利用動(dòng)物提取法和發(fā)酵法進(jìn)行提取制備。

1.1.1 動(dòng)物提取法 動(dòng)物提取法主要是堿提液醇沉工藝[17]、酶法提取工藝[18-19]、堿-酶提取法[8]、堿提-酶解-醇沉法[20]、反向沉淀法[21]、超聲波輔助法[22]、超聲波輔助-堿-雙酶-乙醇法[12]、氯化十六烷基吡啶沉淀法及有機(jī)溶劑沉淀法等,但制得的硫酸軟骨素均為粗品[23]。

高分子量的硫酸軟骨素,由于其表觀黏度高、結(jié)構(gòu)復(fù)雜及細(xì)胞膜的選擇通透性等因素,造成了其生物利用率低、口服吸收差及療效不穩(wěn)定。而低分子質(zhì)量CS具有生物利用度高和活性強(qiáng)等功能特性,越來(lái)越受到人們的重視。徐崢嶸[24]等人以酸性粘多糖酶(透明質(zhì)酸酶、硫酸軟骨素酶和肝素酶)裂解高分子量硫酸軟骨素,并用截留分子量為5000u的超濾膜將生成的低分子量硫酸軟骨素及時(shí)濾除,防止其進(jìn)一步裂解,從而得到高產(chǎn)率的低分子量硫酸軟骨素。此方法克服了硫酸軟骨素酸水解工藝制備產(chǎn)品的分子量分布寬,產(chǎn)品得率低的缺點(diǎn),可高效、大批量制備低分子量硫酸軟骨素,得率在80%以上。史敏娟[25]等人以過(guò)氧化氫+銅離子(Ⅱ)體系自由基法降解制備了低相對(duì)分子質(zhì)量CS,結(jié)果表明:重均分子量從56596降到6906,己糖醛酸、氨基己糖及硫酸根等主要成分變化不大,差異不顯著,降解前后熱分解特性一致。此方法不會(huì)造成硫酸軟骨素主要成分的損失,具有較大的應(yīng)用前景。

1.1.2 發(fā)酵法 硫酸軟骨素是動(dòng)物軟骨中蛋白聚糖的主要成分,是具有少數(shù)幾種細(xì)菌的莢膜多糖。相比于動(dòng)物提取法,微生物發(fā)酵法具有工藝條件溫和,原料豐富,無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn),且產(chǎn)物提取率高,所含雜質(zhì)少,已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

微生物發(fā)酵法提取硫酸軟骨素采用的主要菌株有巴斯德桿菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌三種,它們都能利用以尿苷二磷酸(UDP)前體形式存在的單糖。劉立明[26]等人發(fā)明了一種產(chǎn)硫酸軟骨素菌株(枯草芽孢桿菌)的篩選方法,將菌種接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,培養(yǎng)24h后離心收集發(fā)酵液,發(fā)酵液采用內(nèi)標(biāo)法經(jīng)高效液相色譜進(jìn)行定性分析,使得硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)品峰高增高的菌株即為產(chǎn)硫酸軟骨素的枯草芽抱桿菌。并用該菌株發(fā)酵法生產(chǎn)出硫酸軟骨素。

圍繞發(fā)酵法生產(chǎn)硫酸軟骨素這一研究主題,國(guó)內(nèi)外研究人員已在高產(chǎn)微生物菌株篩選與改良[27-28]、發(fā)酵條件優(yōu)化與控制、硫酸軟骨素合成機(jī)制與調(diào)控機(jī)理等方面開展了卓有成效的研究工作。為發(fā)酵法生產(chǎn)硫酸軟骨素的工業(yè)化奠定了基礎(chǔ)。

1.2 硫酸軟骨素的分離純化研究現(xiàn)狀

硫酸軟骨素的分離純化,多采用溶劑分級(jí)沉淀法[29]、季銨鹽法[14]、超濾膜法、色譜法、電泳法[30]、離子交換法[32]、超濾-離子層析法[33]等。

李燕妮[31]研究了超濾法分離提取雞胸軟骨中硫酸軟骨素和Ⅱ型膠原蛋白的工藝。確定超濾工藝為:雞胸軟骨水解液用截留分子量為10ku的超濾膜,在0.3MPa、10℃截留得到硫酸軟骨素,收率達(dá)97.1%;超濾透過(guò)液用截留分子量為3ku的超濾膜,在0.6MPa、10℃脫鹽濃縮,得到Ⅱ型膠原蛋白,收率達(dá)95.1%。

謝捷[32]等人研究應(yīng)用離子交換法直接從豬鼻骨酶解液中分離純化豬硫酸軟骨素的工藝,并與傳統(tǒng)酶解-氧化法進(jìn)行比較。研究表明:HZ-016型陽(yáng)離子交換樹脂能從豬鼻骨酶解液中分離純化硫酸軟骨素,優(yōu)化后的工藝條件:室溫25℃,上樣質(zhì)量濃度20.5mg/mL,上樣流速1.0mL/min,最大上樣量1BV。離子交換法與傳統(tǒng)酶解-氧化法相比,收率提高6.5%,產(chǎn)品質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高5.6%,雜蛋白含量降低28.6%。

陸釗[33]等采用超濾-離子層析法精制豬硫酸軟骨素,研究了超濾液溫度、超濾壓力、超濾液pH對(duì)豬硫酸軟骨素精制時(shí)膜通量和得率的影響。結(jié)果表明:超濾-離子層析技術(shù)可應(yīng)用于精制豬硫酸軟骨素。豬硫酸軟骨素超濾的工藝條件:以微孔濾膜處理原料液,超濾膜的截留分子量10ku,超濾壓力0.25MPa,超濾溫度25℃,溶液pH為9。產(chǎn)物純度為95.74%,產(chǎn)率為80.15%。

相比于單一的超濾法或離子交換法來(lái)說(shuō),采用雙法聯(lián)合的超濾-離子層析法對(duì)硫酸軟骨素可達(dá)到精細(xì)提取的目的,且所得產(chǎn)物的產(chǎn)率和純度都較高,此法可應(yīng)用于精制CS。

2 硫酸軟骨素的分析研究現(xiàn)狀

2.1 硫酸軟骨素的含量測(cè)定方法

隨著全球市場(chǎng)硫酸軟骨素需求量的增大,其在保健品和臨床中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛,不同的產(chǎn)品硫酸軟骨素含量不同,需要對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行含量鑒定,所以硫酸軟骨素含量測(cè)定方法不論在生產(chǎn)過(guò)程還是產(chǎn)品的質(zhì)量控制過(guò)程中的作用都越來(lái)越重要。

研究硫酸軟骨素的測(cè)定方法主要有高效液相色譜法[34-35]、比濁法[36]、離子對(duì)反相高效液相色譜法[37]、分光光度法[38]、高效毛細(xì)管電泳法[39]、熒光定量分析法[40]、電化學(xué)法[41]、雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法[42]等。分子量的測(cè)定方面有分子排阻色譜(SEC)法,分子排阻色譜和多角度激光光散射聯(lián)用(SEC-MALLS)法[43]。不同方法有其自身的優(yōu)缺點(diǎn),在實(shí)際測(cè)定中應(yīng)該根據(jù)實(shí)際條件和對(duì)結(jié)果的不同要求選擇不同的測(cè)定方法。

不同來(lái)源,不同生產(chǎn)工藝的硫酸軟骨素在含量和結(jié)構(gòu)方面都不相同。目前2010年版《中國(guó)藥典》第二部針對(duì)硫酸軟骨素鈉(硫酸軟骨素鈉片和硫酸軟骨素鈉膠囊)含量測(cè)定的方法是通過(guò)計(jì)算酶解產(chǎn)生的軟骨素二糖、6-硫酸化的軟骨素二糖和4-硫酸化的軟骨素二糖的峰面積之和,計(jì)算出硫酸軟骨素鈉的含量[44]。而目前文獻(xiàn)報(bào)道的硫酸軟骨素的產(chǎn)率和純度差別很大,因此研究簡(jiǎn)便、低價(jià)、快速、精確、安全、穩(wěn)定、重復(fù)性好的測(cè)定方法依然是未來(lái)發(fā)展的趨勢(shì)。

2.2 硫酸軟骨素的結(jié)構(gòu)驗(yàn)證方法

陳士國(guó)[45]等人首次采用高溫核磁共振(1H NMR)對(duì)海參硫酸軟骨素結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步鑒別,結(jié)果表明:高溫條件下海參硫酸軟骨素的1H NMR圖譜具有較好的分辨度。對(duì)其支鏈硫酸化巖藻糖的異頭氫進(jìn)行歸屬和比較,并以此為指標(biāo)鑒別不同種類海參硫酸軟骨素的結(jié)構(gòu)差異,建立了一種以海參硫酸軟骨素結(jié)構(gòu)特征為指標(biāo)的海參指紋圖譜,為海參硫酸軟骨素的構(gòu)效研究提供理論支持。

孫春艷[46]利用近紅外光譜儀對(duì)硫酸軟骨素采集圖譜后,建立相應(yīng)的數(shù)學(xué)模型,為近紅外光譜鑒別其他性狀外觀相似的藥物奠定基礎(chǔ)。王靜[47]利用近紅外光譜分析技術(shù)快速無(wú)損定性鑒別硫酸軟骨素的來(lái)源。分別采用主成分分析法(sIMcA)、偏最小二乘判別分析法(PLS-DA)和支持向量機(jī)方法(SVM)三種模式識(shí)別方法建立硫酸軟骨素來(lái)源的判別模型,對(duì)驗(yàn)證集樣品進(jìn)行預(yù)測(cè),研究結(jié)果表明:利用SVM方法建立數(shù)學(xué)模型,對(duì)硫酸軟骨素來(lái)源進(jìn)行判別分析,模型的預(yù)測(cè)效果較好,達(dá)到了較高的準(zhǔn)確度,可以作為企業(yè)的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn),為硫酸軟骨素進(jìn)行溯源分析提供了新的途徑。

目前,質(zhì)譜技術(shù)在寡糖序列分析中也得到了廣泛應(yīng)用[48-49],但對(duì)于CS質(zhì)譜細(xì)微結(jié)構(gòu)分析,還主要采用酶解和多級(jí)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),該技術(shù)不僅能確定IdoA、GlcA及其硫酸化位置,而且還能確定低硫酸化和多硫酸化寡糖的結(jié)構(gòu),為各種來(lái)源的CS結(jié)構(gòu)分析提供可靠依據(jù)。Zaia等[50]用電噴霧四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜和電噴霧離子井質(zhì)譜串聯(lián)質(zhì)譜法成功測(cè)定了CS二糖和寡糖中硫酸基的位置,并且區(qū)分了糖醛酸的差向異構(gòu)體,得到了近乎完全的CS的結(jié)構(gòu)信息。

3 硫酸軟骨素的功能性研究現(xiàn)狀

目前硫酸軟骨素的功能性研究主要集中在CS的體外抗氧化活性,硫酸軟骨素可通過(guò)抗氧化活性機(jī)制而具有抗纖維化活性,可以清除自由基和延緩衰老。徐瑞聰[51]研究了硫酸軟骨素對(duì)不同自由基的清除能力及硫酸軟骨素的還原能力,從而根據(jù)對(duì)各自由基的清除率和半抑制濃度來(lái)評(píng)價(jià)硫酸軟骨素的抗氧化能力。結(jié)果表明:硫酸軟骨素對(duì)超氧陰離子自由基、羥自由基、DPPH自由基均有清除作用,并隨著濃度的增大,清除作用加強(qiáng),證明了硫酸軟骨素具有一定的抗氧化活性。

同時(shí)CS為結(jié)締組織中天然存在的成分,能夠結(jié)合水分子用于潤(rùn)滑和支撐關(guān)節(jié),使關(guān)節(jié)活動(dòng)自如,有效預(yù)防關(guān)節(jié)炎。CS可作為組織工程化關(guān)節(jié)軟骨天然的生物支架材料,在動(dòng)物體內(nèi)可被降解為氨基葡萄糖,參與代謝,表現(xiàn)出良好的生物相容性和生物可降解性。

此外,CS種類繁多,其功能不盡相同。例如:海參硫酸軟骨素對(duì)大鼠酒精性胃潰瘍具有保護(hù)作用[52],對(duì)小鼠腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有抑制作用[53];從黃鱔中提取出的CS具有降血脂和降血糖的功效[54];鯊硫酸軟骨素具有抗炎癥和抗病毒的作用以及抗動(dòng)脈硬化的功效。硫酸軟骨素-A對(duì)X射線造成的小鼠輻射損傷具有保護(hù)作用[55],尤其是在DNA損傷方面,為發(fā)掘天然抗輻射藥物提供新思路。

4 硫酸軟骨素的應(yīng)用研究現(xiàn)狀

4.1 硫酸軟骨素在醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用

硫酸軟骨素作為風(fēng)濕病、關(guān)節(jié)炎[56-57]、肩周炎、腰痛、神經(jīng)痛、偏頭痛等的治療藥物具有很好的效果,其機(jī)理為CS可直接補(bǔ)充軟骨的基質(zhì)成分、減輕軟骨成分的降解、促進(jìn)軟骨細(xì)胞的代謝、恢復(fù)軟骨細(xì)胞基質(zhì)分泌功能、抑制關(guān)節(jié)內(nèi)多種膠原酶的活性。

硫酸軟骨素還具有其他多種藥理活性,包括減少玻璃體與視網(wǎng)膜的粘連,保存角膜及治療角膜損傷,抗腫瘤,降解囊性纖維變性部位的黏液物,促進(jìn)神經(jīng)軸的再生以及增強(qiáng)軟骨細(xì)胞與軟骨的黏附力等,可用于新藥的開發(fā)。如軟骨組織工程的可注射殼聚糖/硫酸軟骨素復(fù)合水凝膠[58],抗急性炎癥氨基葡萄糖與CS復(fù)合片[59]的制備,骨修復(fù)材料[60]、滴眼液抑菌劑[61]等方面。

此外,硫酸軟骨素與銅等金屬離子結(jié)合可用于治療皮膚病,與硝酸鉍或氫氧化鋁反應(yīng)得到的絡(luò)合物可用于治療消化性潰瘍,與苯甲酸酯、利多卡因或布比卡因作用生成的衍生物可用作麻醉劑。

4.2 硫酸軟骨素在其他方面的應(yīng)用

近些年,硫酸軟骨素還應(yīng)用在食品及保健食品領(lǐng)域中,被用作食品添加劑[47]。加到肉制品中,對(duì)于增強(qiáng)其持水性、保持肉的柔嫩性、掩蓋異味、防止褐變等方面起了很大的作用。美國(guó)藥典-處方集將硫酸軟骨素列為膳食補(bǔ)充劑,CS與其它物質(zhì)(如苯丙氨酸、VB3、VB5、VB6等)調(diào)配可制成止痛膳食。此外,硫酸軟骨素鈉鹽還能消除魚臭,保護(hù)膠質(zhì)性強(qiáng),而且在蛋黃醬中添加后,可改善風(fēng)味、口感及制品的光澤。

硫酸軟骨素含有大量的羧基和硫酸基,它們以多聚陰離子的形式存在,具有保水性、保膠性和高粘性,可與某些物質(zhì)調(diào)制成化妝品,具有強(qiáng)化結(jié)締組織、擴(kuò)張末端血管、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)吸收和廢物排除、改善皮膚細(xì)胞代謝和保持皮膚水分等作用。

5 硫酸軟骨素的發(fā)展前景

5.1 存在的不足

全世界硫酸軟骨素產(chǎn)業(yè)主要集中于我國(guó),約占據(jù)全球產(chǎn)量的80%,是CS最大生產(chǎn)國(guó)和出口國(guó)。2010年上半年,我國(guó)CS出口量為1962t,出口額達(dá)1.3億美元。全國(guó)以山東省為最主要的生產(chǎn)出口省份,每年出口金額達(dá)到2億美元。我國(guó)目前已有一些醫(yī)藥企業(yè)擁有CS原料藥生產(chǎn)的批準(zhǔn)文號(hào),這些企業(yè)都以收購(gòu)CS粗提物和半成品為主,作為其藥物、食品添加劑原料和中間體,進(jìn)一步純化為藥品、食品及化妝品添加劑,因此,對(duì)粗提物和半成品有廣泛需求。

盡管我國(guó)硫酸軟骨素產(chǎn)業(yè)發(fā)展強(qiáng)勁,但仍然面臨原料生產(chǎn)周期長(zhǎng)(動(dòng)物軟骨的生產(chǎn)周期較長(zhǎng))、分布很分散,收集、儲(chǔ)存、運(yùn)輸困難,很難實(shí)現(xiàn)集中大規(guī)模的收購(gòu),產(chǎn)業(yè)水平不高(工藝繁瑣、收率不高、質(zhì)量不穩(wěn))、產(chǎn)品質(zhì)量缺陷(采用γ射線殺菌導(dǎo)致輻射殘留)、污染嚴(yán)重(產(chǎn)生大量的有機(jī)物和蛋白廢水)等制約產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵瓶頸[62]。因此,如何發(fā)展原料豐富、技術(shù)先進(jìn)、質(zhì)量?jī)?yōu)異、清潔環(huán)保的生產(chǎn)工藝是促進(jìn)CS產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵。

5.2 展望

綜上所述,硫酸軟骨素的研究仍有廣闊的前景和發(fā)展空間。開發(fā)來(lái)源豐富,價(jià)格低廉的CS資源,解決原料問(wèn)題;在生產(chǎn)工藝上,力圖研究出與目前國(guó)內(nèi)加工水平相適應(yīng)的生產(chǎn)工藝,降低生產(chǎn)成本;分析技術(shù)上建立相應(yīng)質(zhì)量監(jiān)測(cè)體系;硫酸軟骨素不同組分的分離技術(shù);在活性研究的基礎(chǔ)上重視擴(kuò)展其在功能食品、保健品等領(lǐng)域的應(yīng)用都將是硫酸軟骨素研發(fā)重點(diǎn)。

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