趙潔 馬晨 席曉敏 張和平

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室，呼和浩特 010018）

實時熒光定量PCR技術(shù)在腸道微生物領(lǐng)域中的研究進(jìn)展

趙潔 馬晨 席曉敏 張和平

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室，呼和浩特 010018）

實時熒光定量PCR技術(shù)是目前發(fā)展起來的快速、精確定量核酸的最有效的方法之一，是生物定量分析的強(qiáng)有力的手段。與宏基因組測序等測序技術(shù)相比，實時熒光定量PCR技術(shù)能確定出樣品中菌體的具體數(shù)量，同時具有操作簡便、快速高效、特異性強(qiáng)、高通量等特點，因此被廣泛應(yīng)用于腸道微生物領(lǐng)域中。近年來，在腸道微生物和疾病的相關(guān)研究中，采用實時熒光定量PCR技術(shù)已成為趨勢。綜述了近幾年實時熒光定量PCR在腸道微生物多樣性和飲食干預(yù)在微生物菌群的基因組成方面的研究進(jìn)展。

實時熒光定量PCR 腸道菌群 微生物多樣性

人體寄居著大量的微生物，其中，腸道中的微生物約占微生物總量的78%，數(shù)量超過1 000萬億（1014數(shù)量級）。腸道微生物與宿主形成相互依賴、相互制約的統(tǒng)一體。腸道微生物影響著宿主的消化、免疫和代謝能力，以及宿主的健康狀況；飲食、藥物、環(huán)境等因素影響著腸道微生物菌群平衡。腸道微生物可分為3大類，第一類是有益菌，腸道的優(yōu)勢菌群，約占99%，如乳桿菌、雙歧桿菌；第二類是條件致病菌，腸道的非優(yōu)勢菌群，典型的有腸球菌、腸桿菌，在腸道微生態(tài)平衡時對宿主無害，特定條件下對宿主有害；第三類是致病菌，當(dāng)菌群失調(diào)時會使宿主患?。?］。腸道微生物組中發(fā)現(xiàn)有 9 個門的細(xì)菌，包括厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、梭桿菌科（Fusobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、藍(lán)細(xì)菌（Cyanobacteria）、螺旋體門（Spirochaeates）和VadinBE97門［2］。

腸道微生物菌群數(shù)量龐大，很多微生物無法體外培養(yǎng)，因此其多樣性還未能被完全認(rèn)識。分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了人類對腸道微生物多樣性的認(rèn)識。實時熒光定量PCR（Real-time PCR）技術(shù)憑借其簡便、快速、高通量、無需體外培養(yǎng)等特點，廣泛應(yīng)用于腸道微生物菌群的研究當(dāng)中。一般情況下，腸道微生物組成的研究分為兩大類別，一種是

集中在確定特定基因組成的豐度，如16S rRNA基因；一種是集中在確定干預(yù)效果，如飲食干預(yù)在微生物群的基因組成方面的研究，根據(jù)具體系統(tǒng)分類單元或功能性基因豐度的改變確定結(jié)果。本文綜述了近幾年實時熒光定量PCR技術(shù)在腸道微生物多樣性方面的研究進(jìn)展，同時簡單介紹了該技術(shù)在腸道微生物和疾病的相關(guān)研究中的應(yīng)用。

1 實時熒光定量PCR技術(shù)

實時熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)是在普通PCR技術(shù)基礎(chǔ)之上發(fā)展起來的一種新型核酸定量技術(shù)。實驗室常用的方法有SYBR Green和TaqMan探針法。SYBR Green是結(jié)合在雙鏈的產(chǎn)物上的，TaqMan探針是特異性的針對目的片段設(shè)計的帶有熒光標(biāo)記的互補(bǔ)單鏈序列。SYBR Green在特異性和準(zhǔn)確性方面不如TaqMan探針，但其造價相對較低。因此，在很多試驗中SYBR Green的使用頻率較高。

宏基因組測序目前在腸道微生物菌群的研究中應(yīng)用廣泛，但是與實時熒光定量PCR相比也有一定的缺陷，宏基因組測序技術(shù)能夠確定樣本中微生物的種類，卻無法知道其數(shù)量的多少。實時熒光定量PCR可以發(fā)揮其優(yōu)勢，確定樣本中某一菌種的具體數(shù)量，同時，通過量的對比，可以看出某一因素是否影響腸道微生物菌群。除此之外，實時熒光定量PCR技術(shù)還具有操作簡便、快速、精確、高靈敏度和特異性強(qiáng)等優(yōu)點。因此，該技術(shù)是研究腸道微生物菌群的有力工具。本文總結(jié)了幾種近年研究中定量用到的引物，詳情見表1。

2 腸道微生物多樣性的研究

腸道中微生物種類多、數(shù)量大。宿主年齡、健康狀況等影響其腸道微生物的種類和數(shù)量。許多分子生物學(xué)技術(shù)可用于腸道微生物多樣性的研究。其中，實時熒光定量PCR技術(shù)憑借其復(fù)現(xiàn)性好、特異性強(qiáng)等優(yōu)點，廣泛地應(yīng)用于腸道微生物菌群的定量分析［3］。

Jost 等［4］選擇7個健康的母乳喂養(yǎng)嬰兒的排泄物，采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法、實時熒光定量PCR技術(shù)檢測出生后4-6 d、9-14 d、25-30 d的嬰兒糞便中的細(xì)菌。結(jié)果顯示，在所有嬰兒出生后的第1天，厭氧菌數(shù)量超過兼性厭氧菌。擬桿菌是大多數(shù)嬰兒腸道的第一種細(xì)菌，它的存在證明，出生一周之內(nèi)的嬰兒腸道內(nèi)嚴(yán)格厭氧性菌達(dá)到了類似成人腸道的菌群密度。然而，嬰兒期未測到主要是成人型產(chǎn)丁酸鹽的厭氧菌。因此，有可能在母乳喂養(yǎng)嬰兒期之前，嬰兒腸道內(nèi)兼性厭氧菌已經(jīng)轉(zhuǎn)變?yōu)閲?yán)格厭氧菌，并且非厭氧條件限制了主要產(chǎn)丁酸菌群的建立，也有可能是其他因素。PCR定量雙歧桿菌并不適合于以雙歧桿菌為主的母乳喂養(yǎng)嬰兒腸道微生物特性的研究。因此，Centanni等［5］采用了一種指紋圖譜芯片技術(shù)與實時熒光定量PCR相結(jié)合的方法得到嬰兒微生物群的可靠圖譜。這個方法用于比較8位母乳喂養(yǎng)嬰兒（2-6個月）和5位年輕成年人糞便微生物。結(jié)果顯示，成人腸道菌群占主導(dǎo)地位的是厚壁菌門和擬桿菌門，而嬰兒腸道菌群主要是雙歧桿菌；其次為腸桿菌科。與最新相關(guān)研究一致，從新方法結(jié)果中獲得的微生物群圖譜適當(dāng)?shù)拿枋隽顺赡耆撕蛬雰耗c道菌群情況，證明這種新方法在反映兩種腸道微生物菌群特性方面具有可靠性。Wang 等［6］采用實時熒光定量PCR技術(shù)確定結(jié)腸直腸癌（CRC）患者（n=46）和健康志愿者（n=56）糞便中細(xì)菌的數(shù)量。結(jié)果表明，與健康志愿者相比，CRC患者腸道微生物菌群中產(chǎn)丁酸的細(xì)菌減少。因此，產(chǎn)丁酸細(xì)菌的減少和伺機(jī)致病菌的增加可能導(dǎo)致CRC患者腸道微生物主要結(jié)構(gòu)的失調(diào)。由飲食、功能性食品、抗生素等引起的腸道微生物的改變與宿主的健康相關(guān)。因此，需要一個快速全面的方法檢測腸道微生物菌群的改變。Bergstr?m等［7］建立并確定一個高通量的以實時熒光定量PCR為基礎(chǔ)的分析平臺——腸道低密度陣列（GULDA）。這個平臺同時用來分析不同時間采集的糞便樣中31個不同微生物16S rRNA目標(biāo)基因的豐度的改變。目標(biāo)基因代表重要的類群、屬、種或連同5個主要的腸道細(xì)菌類群，厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、變形菌門、疣微菌門和廣古菌門在內(nèi)的其他分類群。Bergstr?m等分析6個健康嬰兒在出生第9個月和第18個月的糞便樣品，結(jié)果顯示，屬于梭狀芽孢桿菌和兩歧雙歧桿菌的細(xì)菌的相關(guān)豐度增加，同時丁酸梭狀芽孢桿菌的豐度降低，超過9個月的嬰兒糞便中的腸桿菌科也有減少的趨勢。Wang等［8］利用實時熒光定量PCR分析定量患有自閉癥兒童糞便中的細(xì)菌。經(jīng)分析，患有自閉癥兒童的腸道內(nèi)缺乏雙歧桿菌和黏液溶解的細(xì)菌，后者導(dǎo)致黏液屏障發(fā)生變化。Ishikawa等［9］通過實時熒光定量PCR技術(shù)對42個健康的比利時成人一個月內(nèi)腸道微生物菌群的菌群大小和普遍性進(jìn)行檢測，主要針對6大細(xì)菌菌屬、雙歧桿菌屬和脆弱擬桿菌中種的組成進(jìn)行研究。試驗期間，菌群大小和廣泛性基本穩(wěn)定。雙歧桿菌和普氏菌屬的豐度分別為97%和70%，活菌數(shù)數(shù)量級高達(dá)1010。起主導(dǎo)作用的雙歧桿菌是青春雙歧桿菌和長雙歧桿菌；主要的擬桿菌是普氏擬桿菌、單形擬桿菌和卵形擬桿菌。之后將比利時人腸道微生物菌群數(shù)據(jù)與2014年Matsuki等研究的46名日本人腸道菌群相比較。比利時人腸道菌群中的鏈狀雙歧桿菌的菌群大小和廣度明顯低于日本人的（P＜0.001）；然而，雙歧桿菌的菌群大小和廣度卻相同。這類種水平上的實時熒光定量PCR分析對于調(diào)查種族間的腸道微生物菌群的多樣性有所幫助［9，10］。成年人和小孩的腸道菌群均具有多樣性，但是很少有報道提供青少年的腸道微生物組成。Agans 等［12］利用高通量研究方法分析11-18歲青少年腸道末端的微生物群，并在成人組中取樣作對比。

在主成分分析中將青少年組和成人組分開，主成分分析空間以腸道末端微生物菌群的相關(guān)菌種的豐度為基礎(chǔ)。所有的樣品中，梭狀芽孢桿菌屬占主導(dǎo)地位。在所有檢測樣中檢測46個種的一個核心微生物組，核心種屬中瘤胃球菌屬、羅氏菌屬具有很好的代表性。比較青少年和成人腸道微生物組成，數(shù)據(jù)顯示青少年組中梭菌屬和雙歧桿菌屬豐度明顯高于成年組。不同樣品組中檢測的菌種的數(shù)量是一樣的，這表示造成成年組和青少年組不同的是菌屬的相關(guān)豐度而非具體菌屬的存在或缺失。

表1 引物列表

實時熒光定量PCR技術(shù)為腸道微生物的研究提供了便利，通過對人體腸道微生物的定量，我們了解到嬰兒的腸道菌群中占主導(dǎo)地位的是雙歧桿菌和腸桿菌科，隨著年齡的增長雙歧桿菌的數(shù)量逐漸下降，成人腸道菌群中厚壁菌門和擬桿菌門為主導(dǎo)。不同人群的腸道菌群廣度相同，菌群的大小和細(xì)菌數(shù)量不同。

實時熒光定量PCR技術(shù)除了應(yīng)用于研究人體腸道微生物菌群之外，也很廣泛的應(yīng)用于動物腸道微生物的檢測當(dāng)中。Murray 等［13］利用高通量測序（High-throguhput sequencing，HTS）技術(shù)和實時熒光定量PCR技術(shù)分別定量魚糞便中的DNA，兩種方法測得的數(shù)據(jù)相似，通過設(shè)計4種種特異性魚實時熒光定量PCR試驗，得出的數(shù)據(jù)與相同樣本下HTS得出的數(shù)據(jù)相比較，可以直接得出二者的優(yōu)勢和劣勢，可為長期的糞便檢查項目選擇方法。Garcia等［14］采用實時熒光定量PCR技術(shù)直接精確的定量家禽糞便中彎曲桿菌，菌數(shù)可達(dá)2.7×106CFU/mL。該技術(shù)對于評估公共健康風(fēng)險和評價家禽腸道中彎曲桿菌控制措施的有效性具有重要作用。

3 腸道微生物和疾病的相關(guān)研究

近年來，腸道微生物與疾病的相關(guān)研究成為熱點，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)疾病與腸道菌群的失衡有極大的關(guān)系，而實時熒光定量PCR技術(shù)憑借其快捷、精確等優(yōu)點成為腸道微生物研究的有用工具。

我們將身體質(zhì)量指數(shù)（Body mass index，BMI）大于30 kg/m2定義為肥胖，脂肪的大量堆積極大地提高了死亡率并且是引起包括糖尿病、高血壓、呼吸系統(tǒng)紊亂、缺血性心臟病、中風(fēng)和癌癥等疾病的危險因子。肥胖是全球性流行病，在南美洲超過30%的人口肥胖。導(dǎo)致肥胖的原因很復(fù)雜，包括環(huán)境因素、基因因素、神經(jīng)和內(nèi)分泌因素［15-17］。近期，更多的研究將肥胖和腸道微生物菌群聯(lián)系在一起。肥胖影響人體健康并且改變細(xì)菌性腸道微生物菌群，主要是擬桿菌的減少，但還沒有發(fā)現(xiàn)屬和種水平上的數(shù)據(jù)。已有報道稱乳桿菌屬和雙歧桿菌屬在調(diào)節(jié)體重方面扮演重要角色，在實驗?zāi)Ｐ秃腿梭w中具有抵制肥胖的效果。Million等［18］通過實時熒光定量PCR技術(shù)和乳酸桿菌選擇性培養(yǎng)基分析了68個肥胖人群和47個正常人糞便中的細(xì)菌（主要分析的細(xì)菌有厚壁菌、擬桿菌、史氏甲烷短桿菌、乳酸乳球菌、動物雙歧桿菌和7個乳酸桿菌種），首次提供了乳酸桿菌屬具體的一個種與人類肥胖相關(guān)聯(lián)的數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，動物雙歧桿菌和史氏甲烷短桿菌與正常體重有關(guān)，而羅伊氏乳桿菌與肥胖有關(guān)，其中肥胖人群的腸道中史氏甲烷短桿菌數(shù)量減少。2011年，Everard等［19］深入和全面的分析調(diào)查了肥胖和糖尿病小鼠在攝入益生菌之后的腸道微生物菌群和生物參數(shù)。對基因誘導(dǎo)小鼠腸道微生物進(jìn)行分析時用到了實時熒光定量PCR、16S rRNA焦磷酸測序和基因芯片技術(shù)。結(jié)果顯示，攝入益生菌的小鼠的腸道中厚壁菌的數(shù)量減少，擬桿菌的數(shù)量增加，并且有102個細(xì)菌類群的數(shù)量發(fā)生變化。另外益生菌促進(jìn)了葡萄糖耐受，增加了L-cell數(shù)量和相關(guān)參數(shù)，減少脂肪含量、氧化應(yīng)激和低度炎癥。

缺鐵性貧血是全球性的健康問題，通常改善措施就是鐵的營養(yǎng)強(qiáng)化和補(bǔ)充。鐵不僅是人體必需，也是腸道細(xì)菌必不可少的。2012年，Dostal等［20］研究鐵的缺失和充足對小鼠腸道微生物的影響。剛斷奶的小鼠攝入缺鐵性飲食24 d，之后的13 d補(bǔ)充充足的FeSO4或電解質(zhì)鐵，攝入量分別為10和20 mg Fe/kgdiet。另外，一組小鼠（n=8）只攝入缺鐵性飲食；另一組小鼠（n=3）的飲食中有足夠的鐵（作為空白組），喂養(yǎng)37 d。利用時相溫度梯度凝膠電泳和實時熒光定量PCR技術(shù)檢測盲腸中微生物代謝組成和分析糞便中的微生物組成。與攝入足夠鐵的小鼠相比，缺鐵的小鼠體內(nèi)盲腸內(nèi)的丁酸鹽和丙酸鹽濃度分別降低了87%和72%，乳酸桿菌和腸桿菌的數(shù)量增加，主要產(chǎn)丁酸的菌，如羅氏菌和直腸真桿

菌的菌數(shù)明顯降低。在腸道末端，與缺鐵小鼠相比，補(bǔ)充20 mg Fe/kgdiet顯著增加盲腸中丁酸的濃度和部分細(xì)菌的數(shù)量。另外，在腸道微生物方面，補(bǔ)充FeSO4的效果要比補(bǔ)充電解質(zhì)鐵效果強(qiáng)烈。2013年，Dostal等［21］利用結(jié)腸模型接種固定的糞便微生物菌群進(jìn)行體外發(fā)酵來研究Fe缺乏和Fe補(bǔ)充對兒童腸道復(fù)雜的微生物菌群的影響。通過實時熒光定量PCR、16S rRNA基因454焦磷酸測序和HPLC技術(shù)分析每日發(fā)酵液的微生物組成和代謝產(chǎn)物。高Fe和正常Fe的條件下不影響腸道微生物的組成和代謝物活性。與2012年試驗結(jié)果一致，低鐵條件下，羅氏桿菌、直腸真桿菌、擬桿菌降低了一個數(shù)量級，梭菌降低兩個數(shù)量級，而乳桿菌和腸桿菌數(shù)量分別增加了兩個數(shù)量級。在低鐵環(huán)境條件下檢測到主要的腸道菌群代謝產(chǎn)物降低，腸道微生物菌群嚴(yán)重失調(diào)，微生物菌群的屏障效應(yīng)減弱，并對腸道健康產(chǎn)生負(fù)面影響。

實時熒光定量PCR技術(shù)除了應(yīng)用于研究腸道微生物與肥胖和缺鐵性貧血的關(guān)系之外，還涉及到其他方面的研究。P?rtty等［22］將94個早產(chǎn)兒隨機(jī)分配，通過熒光原位雜交和實時熒光定量PCR技術(shù)檢測其腸道微生物菌群。結(jié)果表明，與安靜的嬰兒相比，愛哭的嬰兒腸道內(nèi)乳桿菌、乳球菌、腸球菌和梭狀芽孢桿菌的比例較高，嬰兒雙歧桿菌的菌數(shù)較低，分別為2.5×108CFU/mL和1.3×107CFU/mL。

4 小結(jié)

實時熒光定量PCR技術(shù)是目前發(fā)展起來的快速、精確定量核酸的最有效的方法之一。近幾年實時熒光定量PCR技術(shù)廣泛應(yīng)用于腸道微生物、環(huán)境微生物、致病菌等的檢測中，尤其在腸道微生物的相關(guān)研究中應(yīng)用甚廣。實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作，引物、探針的設(shè)計是難點，因此在實驗過程中對引物的設(shè)計、標(biāo)曲的制作要求很嚴(yán)，同時在操作過程中增加平行避免人員操作對結(jié)果產(chǎn)生誤差。實時熒光定量PCR技術(shù)具有很多優(yōu)點：與傳統(tǒng)的平板計數(shù)法相比，實時熒光定量PCR在無需體外培養(yǎng)的情況下即可對微生物進(jìn)行定量，從而解決了未知微生物和不可培養(yǎng)的微生物的定量問題，并且具有工作量小、重現(xiàn)性高等優(yōu)點；同時該技術(shù)可以定量樣本中某一菌體的具體數(shù)量，而這一優(yōu)點是宏基因組測序等測序技術(shù)無法實現(xiàn)的；實時熒光定量PCR對引物的設(shè)計要求很高，憑借其引物的特異性，該技術(shù)可定量到種的水平，與DGGE等傳統(tǒng)分子技術(shù)相比，該技術(shù)具有其獨特的優(yōu)勢；還有很多分子方法可用于目的核酸序列的定量，但這些方法都存在一些缺點，如費時費力、價格昂貴，有的需要使用放射性物質(zhì)，有的容易交叉污染，而實時熒光定量PCR技術(shù)操作簡便、快速、精確且具有高靈敏度和特異性強(qiáng)等優(yōu)點，同時該技術(shù)是在全封閉狀態(tài)下實現(xiàn)擴(kuò)增及產(chǎn)物分析，有效地減少了污染及對人體的傷害。實時熒光定量PCR技術(shù)為腸道微生物領(lǐng)域的研究提供了便利。在微生物多樣性研究當(dāng)中，我們應(yīng)該將實時熒光定量PCR技術(shù)與其他分子技術(shù)相結(jié)合，從而使實驗結(jié)果更為精確可靠，并且提供更為全面深入的信息。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Advances of Real-time PCR Technology in the Field of Gut Microbiota

Zhao Jie Ma Chen Xi Xiaomin Zhang Heping
（Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering，Ministry of Education，Inner Mongolia Agricultural University，Huhhot 010018）

Real-time PCR is one of the most effective methods, which rapidly accurate quantify nucleic acids. Compared with metagenomic, real-time quantitative PCR can quantify microorganism . Real-time PCR, a simple, fast, efficient, specific and high-throughput method, is widely used in the field of gut microbiology. The technology in studies of intestinal microbes and disease has a wide range of applications. This paper reviews research progress about real-time PCR in the field of intestinal microbial recent years.

Real-time PCR Gut microbiota Microbiota diversity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.010

2014-05-04

農(nóng)業(yè)部現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項目（CARS-37）

趙潔，女，碩士，研究方向：乳品生物技術(shù)與加工工程；E-mail：zhaojie19901021@sina.com

張和平，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：乳酸菌及發(fā)酵乳制品；E-mail：hepingdd@vip.sina.com