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(1. 重慶工商大學催化與功能有機分子重慶市重點實驗室,重慶 400067； 2. 重慶工商大學環(huán)境與生物工程學院,重慶 400067)

肉的腌制過程可對肉起到一定程度的嫩化作用[1]。肉的酸漬腌制過程可通過將肉浸泡在乳酸、醋酸和果汁酸等一些酸液中進行[2]。研究認為,酸腌制對肉的嫩化可能是由于肉在腌制過程中由于膨脹導致肌肉結構的弱化,組織蛋白酶對蛋白的降解變化以及在結合蒸煮過程中,在較低的pH下,膠原蛋白發(fā)生凝膠化變化所致[3]。

膠原蛋白是構成肉中肌內結締組織的主要結構蛋白,在肌原纖維形成肌束和骨骼肌的過程中,以及在肌肉運動過程中對力的維持、傳遞起到極其重要的作用[4]。肌肉膠原蛋白由肌束膜膠原蛋白和肌內膜膠原蛋白兩種構成。研究發(fā)現(xiàn),在肉制品加工過程中膠原蛋白熱力學特性變化對其品質起到一定的影響作用[5]。研究表明,畜禽肌肉品質在一定程度上受到肌束膜和肌內膜膠原蛋白特性的影響,包括其含量、溶解性以及熱收縮溫度等[4]。目前,未見有弱有機酸結合NaCl腌制對肌內肌束膜和肌內膜膠原蛋白含量及熱力特性的研究報道。

本研究以牛半腱肌肉為材料,乳酸、醋酸、檸檬酸和NaCl為腌制劑,探討不同腌制對牛肉中肌束膜和肌內膜膠原蛋白熱力特性的影響,并對其作用機制進行探討,從而為肉類腌制產品的加工及肉類嫩化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 材料與儀器

牛半腱肌 選擇來自同一育肥場、品種和飼養(yǎng)管理相同的土種黃牛的改良后代(西門塔爾×南陽黃牛)公牛5頭,屠宰后牛半胴體在4℃冷庫中成熟48h后進行取樣,從半胴體上取下整條半腱肌,所選胴體其大理石花紋、生理成熟度和背膘厚度等指標基本相似,然后分割成2. 5cm厚肉塊若干個；乳酸、醋酸、檸檬酸和NaCl均為食品級(國產)；其它所用化學試劑均為國產分析純。

MC - DSC差示掃描量熱儀 美國TA Instrument公司;AllegraTM64R Centrifuge臺式高速冷凍離心機 美國Beckman - Coulter公司;Alpha2 - 1. 2冷凍干燥機 德國Christ;Ultra - Turrax T25 BASIC高速勻漿器 德國Ika -Werke公司;直插式pH計 英國Thermo Scientific公司;ZKSY - 600智能恒溫水箱 南京科爾儀器設備有限公司;Shimadzu AUY120電子天平 日本島津公司;GBF - C - 321型雪皇冷藏柜 杭州偉龍制冷設備有限公司;78 - 1型磁力攪拌器 金壇市杰瑞爾電器有限公司。

1. 2 實驗方法

1. 2. 1 腌制處理 將牛半腱肌肉(pH在5. 6 ～ 5. 8之間)分割成2. 5cm×5. 0cm×5. 0cm大小的肉塊(約(100±5)g)若干,隨即分組并稱重,置于下列弱有機酸和NaCl的不同組合腌制劑中,于4℃條件下浸泡腌制24h,其中不經(jīng)腌制處理的作為對照組。腌制處理組分別為:2% NaCl,1. 5%乳酸,1. 5%乳酸+2% NaCl,1. 5%醋酸,1. 5%醋酸+2% NaCl,1. 5%檸檬酸,1. 5%檸檬酸+2% NaCl。每組腌制共6小塊肉樣,肉樣與腌制液之比為1∶ 5(g/mL)。腌制完成后,用吸水紙吸干肉塊表面水分,稱重后進行真空包裝,于4℃貯藏待分析。

1. 2. 2 肌束膜和肌內膜膠原蛋白提取 腌制處理前后肉樣肌束膜和肌內膜膠原蛋白的提取參照Chang等[4]、Li等[6]和常海軍等[7]方法,并作了部分修改。具體方法如下:取40g肉樣(濕重),切成約為1cm3的肉丁,加入50mL預冷的CaCl2(50mmol/L),用高速勻漿器在4000r/min絞碎20s,經(jīng)尼龍網(wǎng)(100目)過濾,濾渣用40mL預冷的50mmol/L CaCl2于4000r/min絞碎10s,再過濾,上述過程再重復2次。濾渣主要成分是肌束膜,合并濾液(主要含肌內膜)。肌束膜組分用1% SDS溶液于室溫下洗20min,靜置后棄上清(去除非蛋白成分),重復洗三次。沉淀放入透析袋于4℃蒸餾水中透析24h,除去SDS,再在40%甲醇溶液中透析24h,最后在蒸餾水中透析24h,去除甲醇,純化后的肌束膜經(jīng)真空冷凍干燥后稱重,其含量以占樣品濕重的百分比計算。

上述得到的濾液在4℃下靜置24h,棄上清。沉淀中加入提取緩沖液(25mmol/L NaCl,2. 5mmol/L組氨酸,pH7. 4)[8],室溫下攪拌5min,于3000r/min離心15min,去上清,重復操作三次,后續(xù)透析純化同上述肌束膜的純化操作一致。

1. 2. 3 肌束膜和肌內膜膠原蛋白DSC分析 經(jīng)分離提取后的肌束膜和肌內膜膠原蛋白用差示掃描量熱儀(DSC)分析其熱量變化(用量5. 0mg),溫度掃描范圍為20 ～ 100℃,升溫速率2℃/min,用TA instrument自帶分析軟件(Universal Analysis 2000)對熱流變化曲線進行分析,計算樣品熱變性溫度。

1. 3 數(shù)據(jù)分析處理

運用SPSS16. 0一般線性模型(GLM)對實驗所得數(shù)據(jù)進行單因素方差(ANOVA)分析、LSD多重比較以及相關性分析。各實驗指標值測定重復3次,結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2. 1 牛肉腌制處理過程中肌束膜和肌內膜膠原蛋白含量的變化

由圖1可見,牛肉經(jīng)不同腌制處理后,與對照組相比,部分處理組肌束膜膠原蛋白含量降低,尤其表現(xiàn)為NaCl、三種不同有機酸的單獨腌制處理。而不同腌制劑的結合腌制處理其肌束膜膠原蛋白含量較單獨腌制處理高,而與對照組之間無顯著差異。而肌內膜膠原蛋白含量在不同腌制處理組之間存在顯著或極顯著差異。

圖1 三種弱有機酸和NaCl結合腌制過程中牛肉肌束膜和肌內膜膠原蛋白含量的變化Fig. 1 Changes in perimysial and endomysial portion contents of intramuscular connective tissue from beef muscle following marination treatment注:不同大寫字母表示差異極顯著(p<0. 01); 不同小寫字母表示差異顯著(p<0. 05)。

肌束膜和肌內膜是構成肌肉結締組織的主要成分,Light等[9]認為肌束膜膠原蛋白對肉嫩度的影響大于肌內膜膠原蛋白,結締組織的量主要由肌束膜決定,而肌內膜起次要作用。牛肉肌束膜含量在單獨腌制劑腌制處理過程中較對照組降低,可能是由于在此過程中肌束膜膠原蛋白發(fā)生變性以及凝膠化轉化所致。本研究結果顯示,不同腌制劑的結合處理一定程度上阻礙了這種變化,其原因可能與不同腌液的pH以及離子強度有關[10]。

2. 2 腌制處理過程中牛肉肌束膜膠原蛋白熱力特性的變化

弱有機酸結合NaCl腌制過程中,牛肉肌束膜和肌內膜膠原蛋白DSC熱流曲線如圖2所示。

圖2 腌制過程中牛肉肌束膜和肌內膜膠原蛋白差示掃描量熱分析熱流曲線Fig. 2 DSC heat flow curve for perimysial and endomysial collagen of beef muscle following marination treatment注:A. 肌束膜膠原蛋白熱流曲線;B. 肌內膜膠原蛋白熱流曲線。

三種弱有機酸和NaCl結合腌制過程中牛肉肌束膜膠原蛋白熱力特性的變化如圖3所示。

圖3 經(jīng)腌制處理后牛肉肌束膜膠原蛋白熱力特性的變化Fig. 3 Changes in thermal shrinkage temperatures of perimysium collagen of beef muscle following marination treatment

由圖3可知,在腌制處理過程中,牛肉肌束膜膠原蛋白3種不同的變性溫度(To變性起始、Tp最大和Te終止溫度)變化趨勢一致。相比對照組而言,NaCl、檸檬酸以及NaCl和檸檬酸結合腌制組牛肉肌束膜膠原蛋白熱穩(wěn)定性變化較小,而乳酸、醋酸以及分別與NaCl結合腌制組牛肉肌束膜膠原蛋白變性溫度有所升高。

To為結締組織膠原蛋白熱變性起始溫度,反映膠原蛋白的最低熱穩(wěn)定性,Tp為最大熱變性溫度,反映膠原蛋白的一般熱穩(wěn)定性,通常用最大熱變性溫度的大小來反映膠原蛋白的熱穩(wěn)定特性[10 - 11]。在乳酸、醋酸以及分別與NaCl的結合腌制處理中,牛肉肌束膜膠原蛋白的熱變性溫度增加,表明其熱穩(wěn)定性更加趨于穩(wěn)定。另外,研究發(fā)現(xiàn),上述處理組中肌肉肌內β - 半乳糖苷酶和β - 葡糖醛酸酶活力都下降,所以對結締組織基質蛋白多糖的水解程度降低,膠原蛋白熱穩(wěn)定性增加[12]。

2. 3 腌制處理過程中牛肉肌內膜膠原蛋白熱力特性的變化

弱有機酸結合NaCl不同腌制劑處理過程中牛肉肌內膜膠原蛋白熱力特性的變化見圖4。

圖4 經(jīng)腌制處理后牛肉肌內膜膠原蛋白熱力特性的變化Fig. 4 Changes in thermal shrinkage temperatures of endomysium collagen of beef muscle following marination treatment

由圖4可見,經(jīng)腌制處理后牛肉肌內膜膠原蛋白Tp和Te溫度較對照組都有所增加。結合圖3和圖4可知,三種弱有機酸和NaCl結合腌制過程中牛肉肌內膜膠原蛋白熱穩(wěn)定性較肌束膜膠原蛋白高,且腌制處理增強了肌內膜膠原蛋白的穩(wěn)定性。

Bailey等[13]報道哺乳動物膠原蛋白的最大熱變性溫度為65℃左右,但對不同的動物屬種和肌肉類型也有差別。有研究報道,在DSC分析過程中,分析參數(shù)設置的不同(如溫度掃描范圍、升溫速率等)以及所分析樣品本身的特性都會影響到結果[11]。本研究中,肌束膜和肌內膜膠原蛋白雖經(jīng)純化分離,但由于腌制處理過程中,不同腌制液pH以及離子強度的影響,部分處理組肌原纖維和膠原纖維發(fā)生變性,導致分離純化過程中可能還含有極少量的肌原纖維成分,另外,肌束膜和肌內膜耐受腌制處理影響程度表現(xiàn)不一致,即受破壞程度不同,二者共同決定了肌肉結締組織膠原蛋白的熱力特性。由本結果可見,肌內膜膠原蛋白的熱穩(wěn)定對其總體影響較大。

有報道稱分離提純后的熱不溶性膠原蛋白經(jīng)乳酸和醋酸處理可以降低其熱變性溫度[14],與本研究結果相反,可能原因是由于不同處理樣品所致,本實驗中是模擬加工工藝中采用整塊肉塊腌制,另外,經(jīng)腌制處理后提取的肌束膜和肌內膜膠原蛋白較熱不溶性膠原蛋白(結締組織濾渣成分)穩(wěn)定性差。

2. 4 相關性分析

在牛肉腌制處理過程中,對肌束膜和肌內膜膠原蛋白含量以及熱力特性之間的相關性分析見表1。

表1 經(jīng)腌制處理后牛肉肌束膜和肌內膜膠原蛋白熱力特性變化相關性分析Table 1 Correlation between thermal characteristic changes of perimysium and endomysium portion collagen following marination treatment

注:PC. 肌束膜膠原蛋白含量;EC. 肌內膜膠原蛋白含量;P - Tp.肌束膜膠原蛋白最大變性溫度(峰溫度);E - Tp. 肌內膜膠原蛋白最大變性溫度(峰溫度);* *. 相關系數(shù)雙尾檢驗極顯著(p<0. 01)。

由表1相關性分析可知,肌束膜和肌內膜膠原蛋白含量與其熱穩(wěn)定性之間相關性不顯著,而肌束膜和肌內膜膠原蛋白最大變性溫度(峰溫度)之間呈極顯著相關,相關系數(shù)為0. 262。

3 結論

牛肉經(jīng)三種弱有機酸(乳酸、醋酸和檸檬酸)以及和NaCl的結合腌制處理使得肌束膜和肌內膜膠原蛋白含量和熱力特性發(fā)生了一定程度的變化。與對照組相比,NaCl以及三種不同有機酸的單獨腌制處理組肌束膜膠原蛋白含量降低,不同腌制劑的結合腌制處理其肌束膜膠原蛋白含量較單獨腌制處理高。牛肉肌內膜膠原蛋白含量在不同腌制處理組之間有顯著差異。腌制處理增加了肌內膜膠原蛋白和部分處理組肌束膜膠原蛋白的熱變性溫度,表明其熱穩(wěn)定性更加趨于穩(wěn)定。結合前期研究表明,腌制處理過程中,牛肉肌束膜和肌內膜膠原蛋白含量以及熱穩(wěn)定性等的變化對肉嫩度和質構等食用品質特性產生顯著影響。

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