董 毅，吳利先

（大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

結(jié)核病是全球流行的傳染病之一，該病是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb，俗稱結(jié)核桿菌）引起的慢性傳染病，可累及全身各器官。全球有1/3的人口感染了結(jié)核桿菌〔1〕，該細(xì)菌具有潛伏感染的特點(diǎn)。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，通過(guò)基因分型可了解結(jié)核分枝桿菌的流行和感染情況。為初步了解大理地區(qū)結(jié)核分枝桿菌的基因分型及流行特征，本研究采用VNTR基因分型技術(shù)對(duì)大理地區(qū)60株臨床分離結(jié)核分枝桿菌菌株進(jìn)行基因多態(tài)性分析，為結(jié)核病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 60株結(jié)核分枝桿菌由大理州疾病預(yù)防控制中心提供的結(jié)核患者的臨床分離株；結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv DNA由大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存，作為本次試驗(yàn)的對(duì)照。

1.2 主要試劑 DNA Marker、Taq DNA聚合酶、dNTP購(gòu)自北京天根生物科技有限公司。

1.3 主要儀器 超凈工作臺(tái)；臺(tái)式高速離心機(jī)；PCR儀；全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)；電泳儀；隔水式恒溫培養(yǎng)箱；超純水機(jī)等。

1.4 結(jié)核分枝桿菌DNA模板制備 采用常規(guī)Lowenstein-Jensen培養(yǎng)基培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)4～6周，有菌落生長(zhǎng)后，在生物安全柜中取生長(zhǎng)良好的結(jié)核菌落溶于500 μL TE緩沖液（pH 8.3）中，100℃煮沸30 min，12000 r/min離心5 min，取上清備用，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 VNTR位點(diǎn)的選擇 參考國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)和基因數(shù)據(jù)庫(kù)〔2-3〕，篩選了3個(gè)VNTR位點(diǎn)，引物序列由北京天根生物科技有限公司合成。見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)中以標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv DNA相對(duì)分子量為參照標(biāo)準(zhǔn)。

表1 引物序列、重復(fù)片斷大小及其在H37Rv中的重復(fù)次數(shù)

1.6 VNTR-PCR 采用25 μL PCR反應(yīng)體系，包括3 μL模板DNA，上下游引物各1 μL，Taq Mixture（含Taq DNA 聚合酶，dNTP，MgCl2等）12.5 μL，ddH2O 7.5 μL，分別用3對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃3 min；循環(huán)94℃40 s，77.3℃ 40 s，72℃ 40 s共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min；4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 瓊脂糖凝膠電泳 PCR產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠恒電壓（10 V/cm）電泳，溴化乙錠染色，應(yīng)用100 bp DNA Ladder作為分子量Marker，標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv DNA做標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。在紫外凝膠成像分析系統(tǒng)下觀察結(jié)果，保存圖片。

1.8 結(jié)果分析 應(yīng)用100 bp DNA Ladder作為分子量Marker，采用Quantity one軟件對(duì)圖片進(jìn)行數(shù)字化處理，計(jì)算出每個(gè)VNTR特異位點(diǎn)的重復(fù)次數(shù)，制作Excel表格，再用BioNumerics 6.6軟件進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)研究選取了3個(gè)VNTR位點(diǎn)對(duì)分離自大理地區(qū)60株結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行了基因分型。見(jiàn)圖1～2。

運(yùn)用軟件BioNmerics 6.6軟件進(jìn)行聚類分析，采用UPGMA（Unweighted Pair Group Method with Arith?metic Mean，非加權(quán)組平均法）將大理地區(qū)結(jié)核分枝桿菌分為4個(gè)基因群（Ⅰ群、Ⅱ群、Ⅲ群、Ⅳ群）28個(gè)基因型。Ⅰ群占15.0%，含有5個(gè)基因型，Ⅱ群占31.7%，含有8個(gè)基因型，Ⅲ群占40.0%，含有11個(gè)基因型，Ⅳ群占13.3%，含有4個(gè)基因型。Ⅲ群所占比例最大，標(biāo)準(zhǔn)菌株也在該群，為大理地區(qū)重點(diǎn)防治的類型。見(jiàn)圖3。

圖1 部分菌株在Qub-11b位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果

圖2部分菌株在Qub-4156位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果

3 討論

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)結(jié)核分枝桿菌分型技術(shù)主要分為非核酸法（傳統(tǒng)方法）和核酸法（分子生物方法），DNA指紋技術(shù)基因檢測(cè)在實(shí)驗(yàn)室污染問(wèn)題、暴發(fā)流行的調(diào)查、醫(yī)院內(nèi)結(jié)核病傳播等方面取得了重大進(jìn)展，展示了良好的前景〔4〕?，F(xiàn)行的分子生物學(xué)方法主要為間隔區(qū)寡核苷酸分型技術(shù)（Spoligotyping）、插入序列限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（IS6110-RFLP）、VNTR、脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）〔5-9〕等技術(shù)。IS6110-RFLP作為結(jié)核分枝桿菌基因分型的金標(biāo)準(zhǔn)，但操作復(fù)雜，結(jié)果分析困難〔10-11〕。

隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展以及結(jié)核分子桿菌H37Rv基因組的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌中存在數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列（VNTRs）。運(yùn)用該方法對(duì)結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行基因分型，操作簡(jiǎn)單可靠、重復(fù)性好、分辨率接近金標(biāo)準(zhǔn)，正被全球廣泛應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌基因分型和結(jié)核分子流行病的研究〔12-13〕。

圖3 60株結(jié)核分枝桿菌BioNumerics聚類分析圖

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