王占軍， 金 倫， 徐忠東， 歐祖蘭

(合肥師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院， 合肥 210061)

麻風(fēng)樹(JatrophacurcasL.)為原產(chǎn)于中美洲的多年生落葉灌木或小喬木，后經(jīng)葡萄牙海員傳播至非洲和亞洲等國家[1-2]。它具有易于種植、抗寒、耐干旱、生長快和適應(yīng)廣泛氣候條件等優(yōu)點(diǎn)[3-5]。以往，麻風(fēng)樹常被用于制藥、生產(chǎn)肥料和防治水土流失等領(lǐng)域[6]；近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)，麻風(fēng)樹的種子含有較高(30%～40%)的與食用油中相似的脂肪酸成分，以及與化石燃料相似的油脂成分[7]，其油脂成分中含有比例高達(dá)80%的亞麻酸和油酸[8]。因此，科研工作者們將麻風(fēng)樹視為生產(chǎn)生物柴油的模式植物[9]，并已在中國、印度和非洲等國家大規(guī)模種植[10]。有關(guān)麻風(fēng)樹的育種目標(biāo)，Maghuly等[2]提出是獲得高油脂產(chǎn)量的優(yōu)良種質(zhì)資源，選擇和繁殖大量優(yōu)良種質(zhì)資源也是完成馴化和提高能夠適應(yīng)不利氣候條件下麻風(fēng)樹產(chǎn)量的首要目標(biāo)。然而，麻風(fēng)樹是一種半野生型植物，Achten等[11]估計(jì)至少需要15年才能完成其從傳統(tǒng)育種到馴化的目標(biāo)，Ye等[12]發(fā)現(xiàn)如此長的研究周期能夠通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)來縮短。因此，發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證出能夠調(diào)控麻風(fēng)樹油脂產(chǎn)量的功能基因，再利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育出具有高油脂產(chǎn)量的麻風(fēng)樹優(yōu)良株系，顯得尤為重要。

LEC1(LEAFYCOTYLEDON1)是編碼CCAAT-box結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子HAP3(Heme-activated protein 3)亞單位的基因，在植物種子發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用[13]。例如，lec1突變體呈現(xiàn)出胚胎發(fā)育異常且不耐干燥[14]、部分種子成熟特異基因表達(dá)缺失和種子貯藏蛋白的表達(dá)量降低等現(xiàn)象[15-16]；而在擬南芥突變體lec1-1中異位過量表達(dá)擬南芥LEC1基因時(shí)，其T1代擬南芥種子中恢復(fù)了lec1突變體的胚胎發(fā)育異常和不耐干燥的表型[13,17]，在T2代擬南芥種子中出現(xiàn)了貯藏蛋白積累的現(xiàn)象[13]。除此之外，Mu等[18]在擬南芥中過量表達(dá)擬南芥和甘藍(lán)型油菜LCE1基因，揭示LEC1基因具有正向調(diào)控12個(gè)脂肪酸生物合成相關(guān)基因表達(dá)的功能，從而控制脂肪酸合成和脂質(zhì)積累。Shen等[19]研究發(fā)現(xiàn)，過量表達(dá)玉米LEC1基因時(shí)提高了其種子的油脂產(chǎn)量(約高達(dá)48%)，但同時(shí)降低了種子的萌發(fā)率，抑制了葉片的生長。在前期研究的基礎(chǔ)上，Tan等[20]利用定向表達(dá)技術(shù)在甘藍(lán)型油菜中表達(dá)其LEC1基因，提高了種子中油脂的含量。

本文選擇功能已知的擬南芥LEC1基因?yàn)閰⒖夹蛄?，利用生物信息學(xué)方法系統(tǒng)地分析麻風(fēng)樹LEC1基因，并將分析結(jié)果與擬南芥LEC1基因的生物信息學(xué)分析結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，同時(shí)解析麻風(fēng)樹LEC1基因的進(jìn)化關(guān)系，旨在為將來麻風(fēng)樹LEC1基因的功能解析提供參考信息。

1 材料與方法

1.1 材料

數(shù)據(jù)為源自于NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的麻風(fēng)樹LEC1基因(序列號(hào)：AEO22132.1)和擬南芥LEC1基因(序列號(hào)：NP_173616.2)的氨基酸序列。

1.2 方法

運(yùn)用Expasy數(shù)據(jù)庫(http://www.expasy.org/tools)中的ProtParam分析編碼蛋白的氨基酸組分，ProtScale工具分析其理化性質(zhì)；采用SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk /services/SignalP)進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測；應(yīng)用TMHMM(www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測蛋白質(zhì)跨膜特征；使用ProtComp(http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=protcomppl&group=programs&subgroup=proloc)進(jìn)行亞細(xì)胞定位；蛋白質(zhì)二級(jí)的結(jié)構(gòu)預(yù)測用SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)完成；蛋白質(zhì)三級(jí)建模用SWISS-MODEL完成；用ProtFun(http://www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/)來預(yù)測蛋白的功能分類；采用NCBI數(shù)據(jù)庫中的CDD(Conserved Domain Database，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析編碼蛋白序列的功能結(jié)構(gòu)域；使用Clustal X2.1實(shí)現(xiàn)氨基酸序列的多重比對(duì)分析；系統(tǒng)進(jìn)化樹用MEGA6.0[21]完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 編碼蛋白的組分和理化性質(zhì)分析

運(yùn)用ProtParam和ProtScale分析麻風(fēng)樹和擬南芥LEC1蛋白，結(jié)果如表1所示。其中，麻風(fēng)樹LEC1蛋白由22種氨基酸組成，共計(jì)226個(gè)氨基酸殘基，其中Ser和Gly含量最高，達(dá)8.8%，不含有Pyl和Sec；其中27個(gè)堿性氨基酸(Arg+Lys)，29個(gè)酸性氨基酸(Asp+Glu)，氨基酸序列的不穩(wěn)定性系數(shù)為47.94(>40)，說明該蛋白的穩(wěn)定性較低；預(yù)測蛋白分子量為25.115 kDa，理論等電點(diǎn)(pI)為6.55，原子組成為C1075H1689N327O344S13，親水性指數(shù)為-0.688，表明其為親水性蛋白。比較麻風(fēng)樹LEC1蛋白與擬南芥LEC1蛋白的氨基酸組成，發(fā)現(xiàn)兩種植物的LEC1蛋白的氨基酸含量最高的都是Ser和Gly，蛋白穩(wěn)定性均較低，并且氨基酸的親水性指數(shù)也相似，均為親水性蛋白。

表1 麻風(fēng)樹和擬南芥LEC1蛋白組分和理化性質(zhì)

2.2 信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位的分析和預(yù)測

表 2 麻風(fēng)樹和擬南芥LEC1蛋白亞細(xì)胞定位結(jié)果

使用SignalP 4.1預(yù)測麻風(fēng)樹和擬南芥LEC1蛋白的信號(hào)肽，結(jié)果表明兩蛋白均不存在信號(hào)肽，據(jù)此推測它們都屬于非分泌型蛋白。TMHMM分析揭示兩種植物的LEC1蛋白都沒有跨膜結(jié)構(gòu)域。ProtComp進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測，表2結(jié)果顯示麻風(fēng)樹LEC1蛋白和擬南芥LEC1蛋白亞細(xì)胞主要都分布在細(xì)胞核內(nèi)。

2.3 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

表 3 麻風(fēng)樹與擬南芥LEC1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的比較

由表3分析結(jié)果可知，麻風(fēng)樹LEC1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲(占50.00%)、α螺旋(占39.38%)和β轉(zhuǎn)角(占7.52%)組成，延伸鏈比例較小(占3.10%)；擬南芥LEC1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是由無規(guī)則卷曲(占53.36%)、α螺旋(占27.73%)和延伸鏈(占13.45%)組成，β轉(zhuǎn)角比例較小(占5.46%)；結(jié)果表明，兩種植物的LEC1蛋白在二級(jí)結(jié)構(gòu)的主體結(jié)構(gòu)相似，但是也存在一定差異。

2.4 三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

將麻風(fēng)樹LEC1蛋白的氨基酸序列上傳至PDB數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank, http://www.rcsb.org/)查找同源序列，使用SWISS-MODEL進(jìn)行蛋白質(zhì)同源建模。通常相似性超過50%即可獲得較精確結(jié)構(gòu)模型，選擇其中同源性最高的序列(PDB編號(hào)：1N1JA，同源性：63.44%)作為模板序列，同源建模結(jié)果如圖1所示；利用Swiss-PdbViewer制作麻風(fēng)樹LEC1蛋白的Ramachandran圖，其中φ(phi)表示圖的橫坐標(biāo)，ψ(psi)為縱坐標(biāo)，根據(jù)Ramachandran圖結(jié)果檢測蛋白建模的合理性。檢測結(jié)果如圖2所示，Ramachandran圖中φ角和ψ角有91.9%處于的合理區(qū)域內(nèi)，表明所模擬的蛋白三維結(jié)構(gòu)是可信的。

圖 1 麻風(fēng)樹LEC1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模擬圖

圖 2 麻風(fēng)樹LEC1蛋白R(shí)amachandran構(gòu)象圖

2.5 蛋白功能預(yù)測分析

ProtFun功能預(yù)測分類結(jié)果如表4所示，麻風(fēng)樹LEC1蛋白具有生長因子、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、荷爾蒙的概率比較高，分別為5.576、1.739和1.103；擬南芥LEC1蛋白含有生長因子、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄的概率比較高，分別為9.395、1.936和1.503。據(jù)有關(guān)功能分析報(bào)道，作為編碼CCAAT-box結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子HAP3亞單位的基因，擬南芥LEC1具有調(diào)控種子發(fā)育過程中重要生長因子的功能[13]；由表4結(jié)果可知，麻風(fēng)樹LEC1蛋白具有作為生長因子和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的可能性較高，但是與擬南芥LEC1蛋白功能預(yù)測結(jié)果不同，麻風(fēng)樹LEC1中荷爾蒙的概率也比較高，推測麻風(fēng)樹LEC1基因的表達(dá)可能會(huì)受到激素的影響。

表 4 麻風(fēng)樹和擬南芥LEC1蛋白的功能預(yù)測

2.6 功能結(jié)構(gòu)域分析

應(yīng)用CDD在線軟件分析麻風(fēng)樹與擬南芥LEC1蛋白的功能結(jié)構(gòu)域，結(jié)果見圖3，在麻風(fēng)樹與擬南芥LEC1蛋白存在高度保守的CBFD-NFYB-HMF結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域是一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活因子，它與含CCAAT-box的DNA 序列相結(jié)合，從而激活啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，據(jù)此推測麻風(fēng)樹LEC1基因也是轉(zhuǎn)錄因子，并且可能具有與擬南芥相似的功能。

2.7 氨基酸序列多重比對(duì)

運(yùn)用NCBI中BLASTP比對(duì)分析麻風(fēng)樹LEC1蛋白的同源序列，篩選出結(jié)果中同源性較高的氨基酸序列，利用Clustal X2.1軟件進(jìn)行多重比對(duì)分析，基于Lotan[13]和Lee[22]等有關(guān)擬南芥和其他生物HAP3亞單位B結(jié)構(gòu)域的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)與圖3功能結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果一致，17條同源性較高的植物L(fēng)EC1蛋白的B結(jié)構(gòu)域也很保守(見圖4)，具有3個(gè)α螺旋和2個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)；其中，麻風(fēng)樹LEC1蛋白在第一個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)中存在DNA結(jié)合序列(MPIANVI)，第2個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)中存在亞基間相互作用的序列(IQECVSECISFI)；該結(jié)果與花生LEC1基因的分析結(jié)果相似[23]；但是多重比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)多種植物的LEC1蛋白在N端和C端差異性較大。

圖3麻風(fēng)樹(圖A)和擬南芥(圖B)LEC1蛋白功能結(jié)構(gòu)域分析

Fig 3 Analysis of conserved domain ofLEC1 protein ofJatropha(Fig. A) andArabidopsis(Fig. B)

圖 4 麻風(fēng)樹LEC1蛋白與其他植物L(fēng)EC1蛋白序列的多重比對(duì)分析

Ah—Arachishypogaea(花生)；At—Arabidopsisthaliana(擬南芥)；Bn—Brassicanapus(甘藍(lán)型油菜)；Dl—Dimocarpuslongan(龍眼)；Gm—Glycinemax(大豆)；Ha—Helianthusannuus(向日葵)；Jc—Jatrophacurcas(麻風(fēng)樹)；Mt—Medicagotruncatula(苜蓿)；Os—Oryzasativa(水稻)；Pc—Phaseolus coccineus(荷包豆)；Pic—Pistaciachinensis(黃連木)；Pm—Pseudotsugamenziesii(花旗松)；Tc—Theobromacacao(可可樹)；Zm—Zeamays(玉米)。

圖 5 麻風(fēng)樹LEC1基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.8 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

使用MEGA6.0軟件分析同源性較高的序列，分別采用鄰接法和最小進(jìn)化法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果兩種方法的進(jìn)化樹結(jié)構(gòu)完全一致。列舉圖5鄰接法分析結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果表明，麻風(fēng)樹LEC1 基因與可可樹LEC1-like基因進(jìn)化關(guān)系最為密切；此外，與花生LEC1B和LEC1A、荷包豆LEC1-like、大豆LEC1B和LEC1A基因關(guān)系較近，但是與功能已知的玉米、擬南芥和甘藍(lán)型型油菜的LEC1基因關(guān)系較遠(yuǎn)，該結(jié)果為后續(xù)通過轉(zhuǎn)基因鑒定麻風(fēng)樹LEC1 基因功能的實(shí)驗(yàn)提供了參考信息。

3 討論

目前對(duì)LEC1基因的功能研究多集中在擬南芥[13-17]、玉米[19]和甘藍(lán)型油菜[18,20]等草本植物上，而有關(guān)木本植物L(fēng)EC1基因功能研究的報(bào)道較少。麻風(fēng)樹擁有生長快、適應(yīng)性強(qiáng)和種子中富含大量油脂成分等優(yōu)點(diǎn)，被育種工作者視為生產(chǎn)生物柴油的重要研究材料，更以培育高油脂產(chǎn)量的麻風(fēng)樹優(yōu)良株系作為主要研究目標(biāo)[2]。本文選擇具有調(diào)控種子發(fā)育過程和油脂產(chǎn)量功能的擬南芥LEC1基因?yàn)閰⒖夹蛄?，采用生物信息學(xué)方法對(duì)麻風(fēng)樹LEC1基因進(jìn)行了系統(tǒng)的分析，主要結(jié)論如下：1)麻風(fēng)樹和擬南芥LEC1蛋白穩(wěn)定性都較低，均屬于親水性蛋白，它們都是既無信號(hào)肽又無跨膜結(jié)構(gòu)域的非分泌蛋白，都主要分布于細(xì)胞核中；2)麻風(fēng)樹和擬南芥LEC1蛋白都存在高度保守的CBFD-NFYB-HMF結(jié)構(gòu)域，推測麻風(fēng)樹LEC1基因可能也是轉(zhuǎn)錄因子，并且具有與擬南芥相似的功能；3)本文中17種植物L(fēng)EC1蛋白含有很保守的B結(jié)構(gòu)域，該區(qū)域是LEC1蛋白重要的功能結(jié)構(gòu)域；4)麻風(fēng)樹LEC1 基因與可可樹LEC1-like基因進(jìn)化關(guān)系最為密切。筆者認(rèn)為，在后續(xù)轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)中，除了選擇擬南芥為受體材料進(jìn)行異位過量表達(dá)和互補(bǔ)突變體表達(dá)試驗(yàn)，以及采用已報(bào)道的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的麻風(fēng)樹轉(zhuǎn)基因技術(shù)[24]，直接開展麻風(fēng)樹轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)外，還可以分析不同激素處理對(duì)轉(zhuǎn)麻風(fēng)樹LEC1基因的受體材料的影響，檢測麻風(fēng)樹LEC1基因的表達(dá)時(shí)空與激素之間是否存在相關(guān)性。Yamamoto等[25]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥LEC1和LEC1-like基因的表達(dá)與脫落酸應(yīng)答元件的響應(yīng)結(jié)合因子(ABA-response element (ABRE)-binding factor)之間的相互作用有關(guān)；此外，最新研究表明，中果咖啡LEC1基因的表達(dá)受到表觀遺傳學(xué)調(diào)控[26]，麻風(fēng)樹LEC1基因是否存在相似的分子調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步分析。2011年，日本科研團(tuán)隊(duì)公布了麻風(fēng)樹全基因組測序結(jié)果[27]，包括其基因組約為285.9 Mb，僅是模式木本植物楊樹全基因組(480 Mb)的59.6%[28]，它的基因總數(shù)共計(jì)40929條，卻占楊樹基因總數(shù)(45555)的89.85%[28]，測序結(jié)果不僅極大地豐富了麻風(fēng)樹的遺傳背景，也為將來開展麻風(fēng)樹LEC1基因及其他基因的表達(dá)分析和功能驗(yàn)證打下了良好的基礎(chǔ)。

本文研究結(jié)果為深入研究麻風(fēng)樹LEC1基因的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)，也為麻風(fēng)樹LEC基因家族的克隆分析提供了參考信息，但是，本文是基于生物信息學(xué)工具對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行系統(tǒng)的研究，關(guān)于麻風(fēng)樹LEC1基因的時(shí)空表達(dá)特性、具體的功能特點(diǎn)及分子調(diào)控機(jī)制等內(nèi)容亟待進(jìn)一步的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。

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