甘振威，武廣恒，劉國良，張婭婕，徐 坤，謝 林，甘 露

（1.吉林大學公共衛(wèi)生學院預防醫(yī)學實驗教學中心，吉林 長春 130021；2.吉林大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學實驗中心，吉林 長春 130021）

維生素與人們健康的關系越來越密切，作為維生素之王的水溶性維生素C（Vc）又稱抗壞血酸，對人體健康起著至關重要的生理作用［1－4］，因此受到了人們的廣泛關注；同時Vc可作為營養(yǎng)新資源、保健食品研發(fā)中一項重要的食品理化檢測指標。而天然Vc廣泛存在于蔬菜和水果中，尤其在花青素較多的深色果蔬中Vc含量極其豐富；Vc是一種含有6個碳原子的酸性多羥化合物［5］，Vc的水溶液極易氧化，受熱、光和堿性等條件影響而破壞。因此，有必要尋找到一種有效的檢測方法，更好地解決深色果蔬中Vc濃度測定的問題。近年來文獻［6－7］報道：Vc濃度測定方法主要有氧化還原滴定法、分光光度法、自動電位滴定法和高效液相色譜法（HPLC）等。常用的氧化還原滴定法方法簡單，但在滴定深色物質(zhì)時，終點不易判斷；分光光度法操作費時；HPLC法靈敏度高，選擇性好，發(fā)展前景較好；自動電位滴定法成本低，操作簡單靈活，更適合少量樣品的測定。因此，有必要尋找到一種有效的檢測方法，更好解決深色果蔬中Vc濃度測定的問題。本文作者研究應用自動電位滴定法和HPLC法檢測果蔬樣品中Vc濃度的可行性和優(yōu)缺點，為少量和批量果蔬中Vc的定量分析提供方法依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、試劑和主要儀器 長春市市內(nèi)超市采購西紅柿、紅柿椒、紫甘藍、紫茄子、紅心蘿卜、紅薯、胡蘿卜、油菜、苦瓜、菜花、韭菜、西蘭花、菠菜、青椒和尖椒15種蔬菜及楊梅、櫻桃、草莓、柑橘、芒果、檸檬、火龍果、紫葡萄、鮮棗、荔枝、西瓜、黃桃、獼猴桃、蘋果及香蕉15種水果樣品；實驗用水為去離子水，Vc標準（GR天津市科密歐化學試劑有限公司），甲醇（Fisher－A4524），草酸（GR，北京化工廠），2，6－二氯酚靛酚（2，6－DCIP）等；自動電位滴定儀（ZD－2A型，上海大中分析儀器廠），高速分散均質(zhì)機（FP－200，江蘇金壇實驗儀器廠），高效液相色譜儀（LC20AD，日本島津公司），超聲波清洗器（KQ－100E，上海京工實業(yè)有限公司），循環(huán)水式真空泵（SHZ－DⅢ，鞏義市英峪儀器廠），色譜柱C18（250.0mm×4.6mm，5.0μm），電子天平（E12140）。

1.2 Vc標準溶液的制備 準確稱取Vc 0.1000g，用0.1%草酸溶解并定容至100mL棕色容量瓶中，儲備液濃度為1g·L－1，冷藏保存。工作溶液用0.1%草酸溶液稀釋儲備液至0.02g·L－1。

1.3 2，6－DCIP溶液的制備及標定 準確稱取2，6－DCIP 0.1000g，溶于300mL含有105mg碳酸氫鈉的沸水中，待溶液冷卻后過濾、定容于500mL棕色容量瓶中，作為儲備液（濃度為0.2g·L－1），冷藏保存。用水將儲備液稀釋成0.02g·L－1作為工作溶液，臨用現(xiàn)配。準確量取Vc工作液20.00mL，置于50mL燒杯中，插入電極，用2，6－DCIP滴定。以消耗2，6－DCIP的體積為橫坐標，電位變化率（△E／△V）為縱坐標作圖，出現(xiàn)△E／△V峰值時，即為等當點（圖1），計算出每毫升2，6－DCIP相當于Vc的毫克數(shù)（T）。

1.4 流動相的處理 配制0.1%草酸溶液2L，用孔徑0.45μm微孔濾膜過濾，過濾液、甲醇溶液一并進行超聲處理10min，待用。

1.5 HPLC標準曲線制備 分別取Vc儲備液100、200、300、400和500μL，用0.1%草酸定容至10.0mL，使?jié)舛确謩e為10、20、30、40和50mg·L－1（圖2）。

1.6 HPLC檢測條件 流動相：0.1%草酸90%，甲醇10%；流速：0.9mL·min－1；UV檢測波長：254nm；柱溫：30℃；進樣量：5.0μL。

1.7 蔬菜和水果樣品的制備 精確稱取所測樣品的可食部分100.00g，加入2～4倍0.1%草酸制成勻漿［8］（勻漿過程在冰水浴中進行），經(jīng)過濾或離心處理，取濾清液定量分成二等份，一份采用自動電位滴定法測試；另一份用HPLC法測試，全過程避光操作。

1.8 樣品中Vc濃度測定 準確量取一等份濾清液20.00mL于小燒杯中，采用自動電位滴定法測定，當△E／△V最大時，即為滴定終點，記錄2，6－DCIP滴定用量，乘以T值，計算所測樣品Vc的毫克數(shù)，再折算出每百克樣品可食部分的量，以mg／100g表示。Vc＝（V1－V2）×T／W×100，式中V1和V2為滴定樣品及空白所用2，6－DCIP毫升數(shù)；W為滴定時所用樣品稀釋液中含樣品的克數(shù)。用HPLC法測定另外一份樣品，將濾清液通過0.45μm一次性濾器過濾到小試劑瓶中，取5.0μL樣品進行測定（濃度高的樣品稀釋后進樣）。計算所測樣品液的Vc濃度（mg·L－1），換算為每百克樣品可食部分的含量，以mg／100g表示。

1.9 準確度和精密度實驗 用標準樣加入法進行Vc回收實驗［9］，計算其回收率。分別用5次平行實驗測定紅柿椒樣品中Vc濃度，計算平行測定的均值、標準偏差及相對標準偏差（RSD）。

1.10 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 14.0軟件進行統(tǒng)計分析。30種蔬菜、水果中的Vc濃度以表示，組間樣品均數(shù)比較采用配對t檢驗。

2 結 果

2.1 自動電位滴定法和HPLC法測定15種蔬菜和15種水果Vc濃度 淺色或無色果蔬樣品Vc濃度比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；在含有花青素或胡蘿卜素較多的深顏色樣品中，Vc濃度比較差異也未見統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。說明自動電位滴定法測定深顏色樣品與HPLC法無區(qū)別，均能克服樣品顏色對結果的影響。見表1。

表1 30種果蔬中Vc濃度Tab.1 Concentrations of Vc in 30kinds of fruits and vegetables［，wB／（mg·100g－1）］

表1 30種果蔬中Vc濃度Tab.1 Concentrations of Vc in 30kinds of fruits and vegetables［，wB／（mg·100g－1）］

11.05±2.6810.78±2.24 Red pepper 101.15±6.0198.96±4.57Cherry 12.10±2.9111.67±2.26 Purple cabbage 21.36±2.5720.65±2.21Strawberry 82.88±5.9684.16±3.03 Purple eggplant 9.08±1.539.84±1.23Citrus 20.61±2.5320.11±2.68 Red radish 22.16±5.8720.56±2.84Mango 18.97±3.1419.08±2.86 Sweet potato 12.45±3.8613.06±3.57Lemon 20.82±3.8422.13±3.57 Carrot 7.55±1.877.16±1.22Pitaya 12.54±2.2511.93±1.85 Rape 29.18±4.8730.26±2.98Purple grape 5.22±1.675.57±1.16 Balsam pear 52.87±3.8851.67±3.39Fresh jujube 380.12±8.21392.55±5.31 Cauliflower 68.46±4.5667.58±4.04Litchi 27.67±2.8728.20±3.05 Leek 26.59±3.5828.09±3.12Watermelon 3.21±1.093.15±0.63 Broccoli 28.94±2.9828.27±2.29Yellow peach 13.88±1.6714.16±1.96 Spinach 32.58±4.6534.58±4.15Kiwi 370.64±7.02368.80±4.69 Green pepper 80.15±3.3479.89±3.79Apple 6.76±1.346.57±1.54 Pepper 103.34±5.24101.16±5.08Banana 3.80±0.95 HPLC Tomato 20.86±2.8121.13±2.52Waxberry Vegetable Vc Automatic potentiometric titration HPLCFruit Vc Automatic potentiometric titration 4.01±1.12

2.2 紅柿椒樣品的準確度和精密度測定實驗 通過紅柿椒樣品的加標法進行Vc的回收率實驗，計算回收率、平均回收率和RSD。自動電位滴定法的回收率為98.34%～103.98%，平均回收率為101.16%，RSD為1.77%～2.88%；HPLC法的回收率為99.66%～101.49%，平均回收率為100.57%，RSD為0.15%～0.32%。見表2和3。

3 討 論

在測定蔬菜、水果中Vc濃度時，常采用氧化還原滴定法（粉紅色為滴定終點）［10］，雖然此方法便捷，但也存在樣品的顏色對測試結果造成偏差的弊端［11］。現(xiàn)今的農(nóng)貿(mào)市場蔬菜、水果種類繁多，帶有顏色的食物隨處可見，而深顏色的果蔬中Vc濃度較高，為便于及時了解其營養(yǎng)情況，給人們的健康飲食提供參考數(shù)據(jù)，找到更合理的測試方法［12］是本實驗研究的目的所在。用自動電位滴定法進行標準Vc濃度的標定時，當?shù)味ㄈ芤?，6－DCIP逐漸增加時，標準Vc溶液中對應離子濃度發(fā)生改變，從而引起測量電極電位的變化，當電極的變化率（△E／△V）達到最大時，即為等當點［13］，隨著2，6－DCIP逐漸增加，△E／△V反而趨于減少。測試樣品時，設定等當點電位值為e0，電極電位變化的信號經(jīng)儀器調(diào)制放大電路處理后，送回取樣回路，通過e－t轉換器控制滴定液流量，當電極信號e與設定終點信號e0相同時，樣品滴定結束。實驗排除了指示劑的使用，減少了利用顏色判斷終點的人為因素，也無需考慮樣品溶液的渾濁度對數(shù)據(jù)的影響，因而提高了測試的準確度和精確度，其回收率為98.34%～103.98%，RSD為1.77%～2.88%，說明此方法具有較高的靈敏度和準確度。

表2 紅柿椒的加標回收率Tab.2 Recovery rate of red pepper

表3 紅柿椒的精密度實驗結果Tab.3 Results of precision test of red pepper

圖1 自動電位滴定法測定等當點曲線圖Fig.1 Equivalent point curve detected by automatic potentiometric titration

圖2 HPLC法測定Vc標準曲線圖Fig.2 Vc standard curve detected by HPLC method

本研究中采用自動電位滴定法和HPLC法對果蔬樣品的Vc濃度進行測定，所得2組數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計學意義；HPLC標準曲線R2＝0.9999，平均回收率為100.57%，RSD為0.15%～0.32%，說明了方法的準確性和可靠性，樣品中的顏色不再影響測試結果。回收率及精密度實驗結果顯示：2種方法均避開了顏色判斷終點所造成的偏差，且均有很好的特異性。自動電位滴定法操作簡便［14］，對單個樣品的測試更具靈活性，成本較低，適合于學生的教學實驗，能夠提高操作者的動手能力；HPLC法是目前較理想的檢驗方法，檢測更快速、有效，且樣品一般不需要衍生過程［15］，但因測試前儀器需要較長時間的穩(wěn)定，測試條件要求較高，相對成本較大，更適合于多樣品同時檢測。

［1］趙昕梅，遠凌威，陳世峰，等.高效液相色譜法測定果蔬中維生素C含量［J］.信陽師范學院學報：自然科學版，2013，26（1）：49－53.

［2］劉淑霞，陳玉娟，李 琳，等.葛根保肝茶對醋氨酚致小鼠急性肝損傷的保護作用［J］.吉林大學學報：醫(yī)學版，2013，39（1）：25－28.

［3］包 宇，楊建雄，孫潤廣.淫羊藿苷與淫羊藿次苷Ⅱ的體外抗氧化作用［J］.吉林大學學報：醫(yī)學版，2012，38（3）：423－428.

［4］朱屋彪，侯 勇，陳健萍.比較不同方法測定蔬菜中維生素C含量［J］.廣東化工，2013，40（8）：148－150.

［5］吳 坤.營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2007：98－100.

［6］王艷穎，姜國斌，胡文忠，等.高效液相色譜法測定草莓中維生素C含量［J］.大連大學學報，2006，27（2）：21－26.

［7］李會靜，張建利，王 亮.高效液相色譜法測定獼猴桃中維生素C的含量［J］.煤炭與化工，2013，36（4）：140－141.

［8］王樂樂，安華明.HPLC測定刺梨果實中維生素C含量方法的優(yōu)化［J］.現(xiàn)代食品科技，2013，29（2）：397－400.

［9］伍云卿，涂杰峰，范 超，等.加標回收實驗方案探討［J］.福建分析測試，2010，19（3）：67－71.

［10］孫 義.水果和蔬菜中維生素C含量的測定方法綜述［J］.天津化工，2008，22（3）：58－59.

［11］陳秋麗，甘振威，張婭婕，等.電位滴定法測定深色蔬菜和水果中的維生素C［J］.吉林大學學報：醫(yī)學版，2004，30（5）：821－822.

［12］朱 佳，孫 杰.高效液相色譜測定維生素C方法的研究進展［J］.食品研究與開發(fā)，2012，33（5）：229－231.

［13］董月菊，梁美霞，戴洪義.利用自用電位滴定法測定果汁中維生素C含量［J］.果樹學報，2010，27（6）：1042－1045.

［14］Ba?B，Jakubowska M，Górski K.Application of renewable silver amalgam annular band electrode to voltammetric determination of vitamins C，B1and B2［J］.Talanta，2011，84（4）：1032－1037.

［15］Franco V，Maria E，Maria S，et al.Optimization and validation of a UV－HPLC method for vitamin C determination in strawberries（Fragaria ananassa Duch），using experimental designs［J］.Food Anal Methods，2012，5（5）：1097－1104.