王 娟，孫 毅，程 龍，宋孚陽(yáng)，李 敏，劉曉明，李 勇

(寧夏大學(xué) a 西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，b 生命科學(xué)學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

自從1997年多莉羊[1]誕生以來(lái)，體細(xì)胞核移植技術(shù)就以其在動(dòng)物繁殖、品種改良及育種中的巨大潛力和廣闊前景而倍受廣大動(dòng)物科技工作者的關(guān)注。目前，國(guó)內(nèi)外有許多實(shí)驗(yàn)室都在進(jìn)行體細(xì)胞克隆技術(shù)的研究，而建立動(dòng)物體細(xì)胞體外培養(yǎng)模式是體細(xì)胞克隆生產(chǎn)的前提。

由于動(dòng)物胎兒成纖維細(xì)胞具有易分離、體外培養(yǎng)生長(zhǎng)速度快、倍增代數(shù)多、染色體倍性穩(wěn)定等特點(diǎn)，故大多數(shù)克隆以胎兒成纖維細(xì)胞為供體， 并已在牛[2]、山羊[3]和豬[4]上取得了成功。

灘羊?qū)儆诙讨惭颍?是中國(guó)唯一生產(chǎn)二毛裘皮用綿羊品種，與浙江湖羊、山東魯西小尾寒羊一樣，是國(guó)家二級(jí)保護(hù)品種，2001年被農(nóng)業(yè)部列入第一批畜禽品種保護(hù)名錄。灘羊體質(zhì)堅(jiān)實(shí)，適應(yīng)荒漠、半荒漠地區(qū)[5]，所產(chǎn)二毛裘皮獨(dú)具一格，羊毛富有光澤和彈性，為紡織提花毛毯的原料。而且，灘羊肉具有細(xì)嫩鮮美，脂肪分布均勻，無(wú)膻腥味等優(yōu)點(diǎn)。因此，對(duì)灘羊種質(zhì)資源特色的保護(hù)及繁育性能的改良成為灘羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展的共性需求。陳亮等[6]曾以灘羊耳緣組織為材料，構(gòu)建了灘羊成纖維細(xì)胞系。本試驗(yàn)以灘羊胎兒皮膚組織為材料，采用組織塊培養(yǎng)分離獲得灘羊胎兒成纖維細(xì)胞，觀測(cè)其形態(tài)和生長(zhǎng)情況，鑒定其性別，并對(duì)其染色體核型和紅色熒光報(bào)告基因(pmCherry-N1)轉(zhuǎn)染等生物學(xué)特性進(jìn)行研究，旨在將這一特有品種的遺傳資源從細(xì)胞水平保存下來(lái)，為灘羊分子育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

灘羊胎兒取自寧夏銀川市紅寺堡天源良種肉羊繁育場(chǎng)。

培養(yǎng)基及主要試劑：DMEM/F12為Gibco公司產(chǎn)品，胎牛血清(FBS)為HyClone公司產(chǎn)品， 胰蛋白酶( 1∶250)、EDTA、DMSO、秋水仙素、 Giemsa、Trypan blue均為Sigma公司產(chǎn)品，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒、Taq酶均為全式金公司產(chǎn)品。

1.2 灘羊胎兒成纖維細(xì)胞的獲取

取妊娠灘羊的體尺為5～8 cm胎兒(約45～60 d胎齡)，置 37 ℃生理鹽水中帶回實(shí)驗(yàn)室，用含有青霉素(100 IU/mL)、鏈霉素(100 IU/mL)的 PBS 洗滌3～5次，用眼科剪將灘羊胎兒皮膚剪切成 1 mm3大小的組織塊，用移液器將碎組織塊移入培養(yǎng)瓶，并均勻地平鋪于培養(yǎng)瓶底部。將培養(yǎng)瓶?jī)A斜(以防添加培養(yǎng)液時(shí)將組織塊沖下)，加入5 mL含體積分?jǐn)?shù)10% FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)液。將有皮膚小塊的一面向上放入培養(yǎng)箱，于體積分?jǐn)?shù)5% CO2、38.5 ℃和飽和濕度下靜置4 h后，將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)[7]，使培養(yǎng)液浸沒(méi)組織塊，盡量避免組織塊浮起，然后繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d換1次培養(yǎng)液。

1.3 灘羊胎兒成纖維細(xì)胞的純化與培養(yǎng)

根據(jù)上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶消化敏感性的不同及二者貼壁速度的差異，可以將二者分離。在混合生長(zhǎng)的原代細(xì)胞中，棄除培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入無(wú)血清PBS漂洗1次，然后加入2 mL孵育好的2.5 g/L胰蛋白酶，在38.5 ℃的培養(yǎng)箱中作用2 min，待70%的細(xì)胞脫壁、變圓、分離成單個(gè)細(xì)胞時(shí)輕輕拍打，使細(xì)胞脫離瓶壁，立即加入4 mL含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的 DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化，將消化后的細(xì)胞混合液加入10 mL的離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，根據(jù)需要接種到新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，通過(guò)2～3次選擇傳代，可完全純化成纖維細(xì)胞，形成成纖維細(xì)胞系。以后視細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝物情況換液，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～90% 匯合時(shí)進(jìn)行傳代。

1.4 灘羊胎兒成纖維細(xì)胞的凍存及復(fù)蘇

1.4.1 細(xì)胞凍存 處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的成纖維細(xì)胞在凍存前24 h更換新的完全培養(yǎng)液。按常規(guī)傳代方法消化細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液，將單細(xì)胞懸液收集于10 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min，去上清液，收集細(xì)胞；加入4 ℃預(yù)冷的凍存液(DMEM+體積分?jǐn)?shù)30% FBS+體積分?jǐn)?shù)10% DMSO)，將懸液分裝于無(wú)菌塑料凍存管中，嚴(yán)密封口，并注明細(xì)胞名稱(chēng)、培養(yǎng)代數(shù)、凍存編號(hào)、凍存日期等。將凍存管放在4 ℃冰箱中40～60 min，然后懸掛在液氮液面以上過(guò)夜，次日放入液氮罐中分類(lèi)保存[8]。

1.4.2 細(xì)胞復(fù)蘇 將凍存的細(xì)胞快速?gòu)囊旱腥〕?，快速投?9 ℃水浴中，并在水浴中不斷快速搖動(dòng)凍存管以迅速解凍，待冷凍液徹底解凍后， 加孵育好的新鮮培養(yǎng)液稀釋至4～5 mL，并將溶解液轉(zhuǎn)移至離心管中，再以1 000 r/min離心5 min，以達(dá)到去除DMSO以緩解冷凍液毒性，用新鮮的培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞沉淀，將細(xì)胞稀釋至所需濃度，接種培養(yǎng)[9]。

1.5 灘羊胎兒成纖維細(xì)胞的生物學(xué)特性檢測(cè)

1.5.1 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的成纖維細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后用培養(yǎng)液稀釋?zhuān)瑢⒓?xì)胞密度調(diào)整至大約4×104個(gè)/mL，接種培養(yǎng)于24孔培養(yǎng)板，每孔加入1 mL培養(yǎng)液，每隔24 h收集4個(gè)孔的細(xì)胞并計(jì)數(shù)，取平均值，接種日期記為0 d,連續(xù)記錄7 d。將計(jì)數(shù)結(jié)果輸入計(jì)算機(jī)處理，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖，并求得細(xì)胞群體倍增時(shí)間參數(shù)[10]。

1.5.2 成纖維細(xì)胞系的性別鑒定 參照天根全基因組提取試劑盒操作說(shuō)明書(shū)，取部分灘羊胎兒成纖維細(xì)胞提取基因組DNA。

根據(jù)GenBank 已發(fā)表的綿羊Sry基因序列(GenBank號(hào)：JN992673.1)設(shè)計(jì)1對(duì)引物，上游引物:5′-AGC GGT GGT ACA GCAACA AA-3′；下游引物:5′-TGT GCC TCC TCA AAAGAAT GG-3′，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系：待測(cè) DNA 樣品2 μL，上、下游引物各1 μL，Taq酶0.5 μL，dNTP 2 μL，10×Buffer 5 μL，ddH2O 38.5 μL，總體積 50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 45 s；59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存?zhèn)溆肹11]。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行8 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.5.3 細(xì)胞染色體制備與核型分析 取純化后5代、15代和25代的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期成纖維細(xì)胞，加入含0.1 μg/mL秋水仙素的DMEM/F12培養(yǎng)液6～8 mL培養(yǎng)4～6 h，用2.5 g/L的胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，逐滴加入37 ℃預(yù)熱的0.075 mol/L KCl 10 mL，37 ℃低滲處理20～30 min，1 000 r/min離心5 min。棄上清，向沉淀細(xì)胞加入現(xiàn)配制的固定液(V(甲醇)∶V(冰醋酸)=3∶1)1 mL，預(yù)固定5 min，1 000 r/min離心10 min，棄上清液，加現(xiàn)配制固定液10 mL懸浮細(xì)胞，室溫靜置30 min， 1 000 r/min離心10 min，棄上清液，再固定1次。向2次固定后的細(xì)胞沉淀中加固定液，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量的多少制成細(xì)胞懸液，用微細(xì)管吸取細(xì)胞懸液，在距載玻片上方大于1 m處滴于-20 ℃冰凍載玻片上。過(guò)酒精燈火焰，使其快速干燥或自然干燥，然后用姬姆薩磷酸緩沖液(V(姬姆薩原液)∶V(磷酸緩沖液)=1∶9)染色15 min，流水沖洗40 s，自然干燥或酒精燈加熱干燥，樹(shù)膠封片，姬姆薩染色后，油鏡下觀察并拍照，對(duì)鋪展完好的中期相統(tǒng)計(jì)染色體數(shù)目[12]。

1.5.4 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前24 h,將成纖維細(xì)胞以2×105個(gè)/孔的量接種到六孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加2 mL培養(yǎng)基。在38.5 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)到70%～80%匯合時(shí)，備用。將4 μg攜帶有紅色熒光報(bào)告基因質(zhì)粒(pmCherry-N1)的DNA在400 μL opti-mem培養(yǎng)液中稀釋?zhuān)偌? μL puls混勻靜置5 min后，加入8 μL Lipofectamine LTX小心混勻，室溫下靜置30 min，形成DNA-脂質(zhì)體混合物。將混合物加入六孔板中，12 h后換含體積分?jǐn)?shù)10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)， 24 h后傳代加入G-418，對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行篩選。對(duì)篩選出的細(xì)胞進(jìn)行生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)和核型分析，以檢測(cè)轉(zhuǎn)染后灘羊胎兒成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)能力和遺傳物質(zhì)的變化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 灘羊胎兒成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)

灘羊胎兒組織塊貼壁后第2天即可見(jiàn)到細(xì)胞從組織塊邊緣向外生長(zhǎng)，成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞均有，隨后迅速向外擴(kuò)散， 培養(yǎng)3 d左右80%～90%細(xì)胞可匯合(圖1A)， 此時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代， 之后成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)逐漸占優(yōu)勢(shì)，再傳代2～3次便可得到純化的灘羊胎兒成纖維細(xì)胞。灘羊胎兒成纖維細(xì)胞呈梭形、長(zhǎng)條形、多角形或不規(guī)則形。多數(shù)情況下，細(xì)胞之間排列疏松，有較大細(xì)胞間隙，有時(shí)也有平行排列，成群細(xì)胞呈放射狀或漩渦狀分布(圖1B)。

圖1 灘羊胎兒成纖維細(xì)胞

2.2 灘羊胎兒成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

連續(xù) 7 d定時(shí)計(jì)數(shù)接種于 24孔培養(yǎng)板的細(xì)胞，記錄各次細(xì)胞密度，繪制成細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，灘羊胎兒成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)總體趨勢(shì)均呈“S”型，并沒(méi)有因?yàn)閭鞔螖?shù)的增加而發(fā)生改變。細(xì)胞生長(zhǎng)共經(jīng)歷了潛伏生長(zhǎng)期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和平臺(tái)生長(zhǎng)期3個(gè)時(shí)期。剛剛接種細(xì)胞均有 24 h的潛伏期，此期為細(xì)胞的適應(yīng)階段，是細(xì)胞由于接種時(shí)胰蛋白酶消化而致的損傷后的修復(fù)時(shí)期；接種第2天起細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，其倍增時(shí)間約為48 h，這是細(xì)胞生長(zhǎng)最快的時(shí)期；從第5天起細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，進(jìn)入平臺(tái)生長(zhǎng)期，隨后可見(jiàn)有細(xì)胞死亡，這是由于細(xì)胞缺乏生長(zhǎng)可利用的空間，出現(xiàn)接觸抑制和密度抑制所致。

圖2 灘羊胎兒成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

2.3 灘羊胎兒成纖維細(xì)胞系的性別鑒定

共檢測(cè)了5個(gè)灘羊胎兒成纖維細(xì)胞系樣品，結(jié)果(圖3)顯示，1、2號(hào)樣品無(wú)特異性擴(kuò)增帶，可以判斷這2個(gè)細(xì)胞系為雌性；3、4、5號(hào)樣品均擴(kuò)增出約130 bp的特異性條帶，說(shuō)明這3個(gè)細(xì)胞系為雄性。

圖3 灘羊胎兒成纖維細(xì)胞系的性別鑒定

2.4 灘羊胎兒成纖維細(xì)胞的染色體分析

在油鏡下觀察灘羊胎兒成纖維細(xì)胞的染色體標(biāo)本的形態(tài)并計(jì)數(shù)，每代細(xì)胞隨機(jī)選取10個(gè)中期分裂細(xì)胞染色體進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果(圖4)表明，5代、15代和25代灘羊染色體全部為 2n=54。說(shuō)明所研究的灘羊胎兒成纖維細(xì)胞染色體數(shù)目為 2n=54，為穩(wěn)定的二倍體細(xì)胞系，且未隨著傳代次數(shù)的增加造成染色體的缺失，可以作為體細(xì)胞核移植的供體細(xì)胞。

圖4 不同代數(shù)灘羊胎兒成纖維細(xì)胞的染色體及核型分析(×1 000)

2.5 灘羊胎兒成纖維細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染標(biāo)記基因

灘羊胎兒成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染pmCherry-N1重組質(zhì)粒后12 h，可見(jiàn)部分細(xì)胞發(fā)紅色熒光，分布較松散，亮度較弱(圖5A)；24 h 陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多，低倍鏡視野內(nèi)可見(jiàn) 50%左右，未轉(zhuǎn)染細(xì)胞則無(wú)熒光顯示(圖5B)；轉(zhuǎn)染24 h后，傳代加入藥物，經(jīng)過(guò)1周的篩選，可觀察到無(wú)熒光細(xì)胞均已死亡，陽(yáng)性細(xì)胞亮度增強(qiáng)(圖5C)。

圖5 pmCherry-N1轉(zhuǎn)染灘羊胎兒成纖維細(xì)胞(×100)

對(duì)篩選后的第5代、10代灘羊胎兒成纖維細(xì)胞進(jìn)行染色體核型分析，并繪制生長(zhǎng)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖6和圖7。染色體核型分析結(jié)果(圖6)表明，第5代、10代單克隆轉(zhuǎn)染細(xì)胞染色體全部為2n= 54，說(shuō)明轉(zhuǎn)染后的灘羊胎兒成纖維細(xì)胞染色體沒(méi)有發(fā)生缺失情況，且藥物的篩選也沒(méi)有對(duì)灘羊胎兒成纖維細(xì)胞的遺傳物質(zhì)造成改變。由圖7可知，獲得的單克隆轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長(zhǎng)總體趨勢(shì)呈“S”型，與正常成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線相同，都包括潛伏生長(zhǎng)期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和平臺(tái)生長(zhǎng)期3個(gè)時(shí)期，且單克隆轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長(zhǎng)趨勢(shì)并未因?yàn)閭鞔螖?shù)的增加而有所改變。

圖6 不同代數(shù)轉(zhuǎn)染pmCherry-N1灘羊胎兒成纖維細(xì)胞的染色體及核型分析(×1 000)

圖7 轉(zhuǎn)染pmCherry-N1質(zhì)粒后灘羊胎兒成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

3 討 論

3.1 成纖維細(xì)胞分離方法的選擇

原代細(xì)胞分離方法主要有組織塊法和酶消化法。對(duì)于胎兒成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)，有的采用組織塊法，有的采用酶消化法，有的進(jìn)行原代培養(yǎng)時(shí)2種方法都采用[13]。在酶消化法中酶作用時(shí)間長(zhǎng)易對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷，損傷后的細(xì)胞不易貼壁，而灘羊的體細(xì)胞核移植對(duì)供體的選擇要求嚴(yán)格，細(xì)胞必須具有高活力。組織塊法具有操作簡(jiǎn)便，對(duì)組織、細(xì)胞損傷小，污染機(jī)率小，成功率高等優(yōu)點(diǎn)，適用于各種細(xì)胞培養(yǎng)，因此本試驗(yàn)采用組織塊法分離培養(yǎng)灘羊胎兒成纖維細(xì)胞，為核移植提供了量足質(zhì)優(yōu)的供體細(xì)胞。組織貼壁是組織塊法的關(guān)鍵環(huán)節(jié)， 只有貼壁后細(xì)胞才能很好地生長(zhǎng)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在原代培養(yǎng)時(shí)，先將組織塊貼在底壁上，組織塊帶有少量培養(yǎng)液為宜，然后倒置在培養(yǎng)箱中4 h 后加入培養(yǎng)液，一般培養(yǎng)1 d后有細(xì)胞長(zhǎng)出。本試驗(yàn)要構(gòu)建細(xì)胞系，樣本含量小，而且組織塊小，因此選擇組織塊貼壁培養(yǎng)較為合適。

3.2 成纖維細(xì)胞的性別鑒定

Sry基因的表達(dá)決定了胚胎沿雄性方向分化，特異性擴(kuò)增Sry基因的核心序列就可以對(duì)動(dòng)物胚胎或細(xì)胞進(jìn)行性別鑒定。本試驗(yàn)根據(jù)綿羊Sry基因同源序列設(shè)計(jì)的這對(duì)引物，通過(guò)一次擴(kuò)增反應(yīng)，能有效地?cái)U(kuò)增出雄性灘羊Sry基因的一段近130 bp特異性片段，由此可判斷有130 bp 擴(kuò)增帶的細(xì)胞系為雄性,而無(wú)此帶的為雌性。這為轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物研究中及早地轉(zhuǎn)染目的基因，以及保存和擴(kuò)增性別已知的胎兒成纖維細(xì)胞系提供了可靠的依據(jù)。

3.3 成纖維細(xì)胞的染色體分析

染色體數(shù)目及核型能鑒定細(xì)胞是否趨于穩(wěn)定，以及在離體培養(yǎng)條件下細(xì)胞是否發(fā)生轉(zhuǎn)化。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，由于培養(yǎng)條件的變化和其他不利因素的影響，細(xì)胞生物學(xué)性狀可能發(fā)生變化。隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)和傳代次數(shù)的增加，不僅會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞停止生長(zhǎng)，甚至失掉二倍體性狀，因此以資源保存為目的的細(xì)胞培養(yǎng)要保證二倍體的穩(wěn)定性就顯得尤為重要。本試驗(yàn)結(jié)果表明，灘羊胎兒成纖維細(xì)胞染色體數(shù)目為 2n=54，為穩(wěn)定的二倍體細(xì)胞系，且沒(méi)有隨著傳代次數(shù)的增加造成染色體的缺失，可以作為體細(xì)胞核移植的供體細(xì)胞。

3.4 成纖維細(xì)胞的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染

細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)目前被廣泛應(yīng)用于各種基因結(jié)構(gòu)與功能以及基因調(diào)控等研究領(lǐng)域。本研究使用的 Lipofectamine LTX是人工合成的陽(yáng)離子脂質(zhì)體，它和帶負(fù)電荷的櫻桃紅熒光蛋白報(bào)告基因質(zhì)粒(pmCherry-N1)結(jié)合后形成復(fù)合物，當(dāng)復(fù)合物接近細(xì)胞膜時(shí)被內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，隨后 DNA 復(fù)合物被釋放進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，所建的灘羊胎兒成纖維細(xì)胞系的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較高，約為50%，說(shuō)明外源基因能在灘羊胎兒成纖維細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行有效的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯及正確翻譯后修飾，且外源基因表達(dá)所需的一些調(diào)控元件也能在這種成纖維細(xì)胞中有效工作[14]。轉(zhuǎn)染后灘羊胎兒成纖維細(xì)胞染色體沒(méi)有發(fā)生缺失情況，說(shuō)明轉(zhuǎn)染沒(méi)有造成灘羊胎兒成纖維細(xì)胞遺傳物質(zhì)的改變，細(xì)胞可以滿足供體細(xì)胞的要求。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Wilmut I,Schnieke A E,McWhir J,et al.Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells [J].Nature,1997,385(6619):810-813.

[2] Schnieke A E,Kind A J,Ritchie W A,et al.Human factor Ⅸ transgenic sheep produced by transfer of nucleifrom transfected fetal fibroblasts [J].Science,1997,278(5346):2130-2133.

[3] Baquisi A,Behboodi E,Melican D T,et al.Production of goats by somatic cell nuclear transfer [J].Nat Biotehnol,1999,17:456-461.

[4] Onishi A,Iwamoto M,Akita T,et al.Pig cloned by microinjection of fetal fibroblast nuclei [J].Science,2000,289(5482):1188-1190.

[5] 趙曉勇，牛文智.寧夏灘羊發(fā)展現(xiàn)狀的分析與思考 [J].中國(guó)草食動(dòng)物，2008，28(1)：50-51.

Zhao X Y,Niu W Z.Analysis of the status and development of Ningxia Tan sheep [J].China Herbivores,2008,28(1):50-51.(in Chinese)

[6] 陳 亮，劉丑生，王新莊，等.灘羊成纖維細(xì)胞系的建立及其生物學(xué)特性研究 [J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2010，37(6)：50-54.

Chen L,Liu C S,Wang X Z,et al.Establishment of fibroblast cell line and its biological characteristics in Tan sheep [J].China Animal Husbandry & Veterinary Medicine,2010,37(6):50-54.(in Chinese)

[7] Freshney R I.Animal cell culture:A practical approach [M].[S.l.]:Oxford University Press,1992:119-122.

[8] Joydeep D,Asha K.Chromosomal profile of dwarf chickens [J].Indian Journal of Poultry Science,2000,35(2):152-155.

[9] 門(mén)正明，劉 霞，馬海明，等.蘭州大尾羊染色體組型分析 [J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002,37(2)：158-160.

Men Z M,Liu X,Ma H M,et al.Karyotype analysis of Lanzhou Fat-Tailed sheep [J].Journal of Gansu Agricultural University,2002,37(2):158-160.(in Chinese)

[10] 嚴(yán)泉?jiǎng)?，郭金龍，劉恩靖，?繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及細(xì)胞群體倍增時(shí)間的簡(jiǎn)化計(jì)算 [J].前衛(wèi)醫(yī)藥雜志，2000，17(4)：228-229.

Yan Q J,Guo J L,Liu E J,et al.The calculation of doubling time and curve evaluation to a cell line [J].Qianwei Journal of Medicine & Pharmacy,2000,17(4):228-229.(in Chinese)

[11] 馬忠輝，趙巧香，楊煥民.牛胎兒成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)及性別鑒定 [J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2009(4)：19-21.

Ma Z H,Zhao Q X,Yang H M.Culture and sex identification of cattle fetal fibroblast [J].Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine,2009(4):19-21.(in Chinese)

[12] 巴特爾，周歡敏.阿爾巴斯絨山羊皮膚成纖維細(xì)胞系的建立 [J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2010(4)：1-3.

Ba T E,Zhou H M.The establishment of f ibroblast cell lines in Arbas cashmere goat [J].Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine,2010(4):1-3.(in Chinese)

[13] 宓曉黎，李利東，黃麗俊，等.環(huán)丙沙星免疫抗原的合成與鑒定 [J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2010，20(6)：1292-1293.

Mi X L,Li L D,Huang L J,et al.Synthes is and identification of artificial antigens of ciprof loxacin [J].Chinese Journal of Health Laboratory Technology,2010,20(6):1292-1293.(in Chinese)

[14] 周向梅，馬月輝，關(guān)偉軍，等.北京油雞胚胎成纖維細(xì)胞系建立與生物學(xué)特性研究 [J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2005，36(3)：209-215.

Zhou X M,Ma Y H,Guan W J,et al.Establishment and characteristics of a Beijing fatty chicken embryo fibroblast cell line [J].Chinese Journal of Animal and Veterinary Sciences,2005,36(3):209-215.(in Chinese)