周 鵬，池 青，呂金洋，劉香利，趙惠賢

(1 旱區(qū)作物逆境分子生物學國家重點實驗室，陜西 楊凌 712100；2 西北農(nóng)林科技大學 生命科學學院，陜西 楊凌 712100)

近些年來，由于溫室效應(yīng)的影響，全球的氣候逐漸變暖，人們忽略了凍害對農(nóng)作物的影響，但是全球變暖并不意味著不會發(fā)生農(nóng)作物的低溫凍害，全球變暖同時伴隨著的是極端氣候和天氣事件發(fā)生概率的增加，2008年的冬季發(fā)生在我國大面積的凍害就直接造成國家種植業(yè)經(jīng)濟損失670億元[1]。隨著弱冬性小麥種植面積不斷擴大，凍害已經(jīng)成為制約弱冬性小麥種植面積擴大和產(chǎn)量增加的主要自然災(zāi)害之一。目前常規(guī)的防止小麥低溫凍害的措施主要有：選擇優(yōu)良的耐寒品種、控制播種時期和數(shù)量、肥水調(diào)控、幼苗抗寒鍛煉以及采用化學調(diào)控技術(shù)等[2]。其中，選擇優(yōu)良的耐寒品種是提高弱冬性小麥生產(chǎn)的最經(jīng)濟有效的途徑。然而，利用常規(guī)育種方法培育耐寒小麥品種不僅周期長，而且很難使小麥抗寒能力有很大提高。隨著功能基因研究的飛速發(fā)展，使得利用基因工程技術(shù)直接將目標性狀基因轉(zhuǎn)入受體小麥進行品種定向改良得以實現(xiàn)，并且將逐漸成為常規(guī)育種的一種有效補充途徑。目前，對小麥進行定向改良的轉(zhuǎn)基因技術(shù)主要包括基因槍法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和花粉管通道法。利用這些技術(shù)已經(jīng)成功獲得抗病[3-5]、抗蟲[6-7]、抗逆[8]、品質(zhì)改良[9-10]、產(chǎn)量提高[11-12]等小麥轉(zhuǎn)基因植株，其中應(yīng)用較多的是抗病和品質(zhì)改良。

超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、谷胱甘肽還原酶(GR)等與植物的抗凍性密切相關(guān)，其中在小麥體內(nèi)起主要作用的是SOD和APX[13-14]。目前，通過轉(zhuǎn)基因育種的方法已經(jīng)成功將一些具有抗凍功能基因轉(zhuǎn)入到植物體內(nèi)，并且使植物的抗凍性有一定程度提高。Georges等[15]將人工合成的黃蓋鰈魚抗凍蛋白基因成功導(dǎo)入到玉米的原生質(zhì)體內(nèi)，并且在植物的細胞中獲得了表達。Fan等[16]將從胡蘿卜幼苗中克隆到的一個抗凍蛋白基因(AFP)轉(zhuǎn)入到煙草中，發(fā)現(xiàn)在0 ℃的條件下，轉(zhuǎn)基因煙草受到的凍害明顯小于非轉(zhuǎn)基因煙草。Parvanova等[17]將擬南芥中脯氨酸合成相關(guān)的吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)基因成功轉(zhuǎn)入到煙草中，經(jīng)過-2 ℃低溫處理24 h后，轉(zhuǎn)基因植株存活而對照植株死亡。Mckersie等[18]從煙草中克隆了編碼SOD的cDNA，并將其轉(zhuǎn)入苜蓿體內(nèi)，使轉(zhuǎn)基因植株的抗凍性有明顯提高。郭北海等[19]從榆錢菠菜中克隆出編碼甜菜堿醛脫氫酶(BADH)的cDNA,并將其轉(zhuǎn)入小麥品種石90-4185中；Zhang等[20]對上述郭北海等獲得的轉(zhuǎn)基因小麥植株進行抗凍性檢測，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株體的抗凍性明顯高于對照植株。KN2基因是從南極魚中克隆的一個編碼超氧化物歧化酶的基因，該基因可能具有增強生物體抗凍性的功能，但有關(guān)KN2基因提高作物抗寒性的研究尚未見報道。

小偃22是西北農(nóng)林科技大學李璋研究員以小偃6號×775-1的雜種F1代作母本，小偃107作父本，經(jīng)過復(fù)核雜交、系統(tǒng)選育而成的弱冬性小麥品種，該品種具有高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病等優(yōu)點，適宜于陜西關(guān)中新老灌區(qū)水肥條件較好的地塊及塬區(qū)旱肥地種植，也適宜在黃淮麥區(qū)同類生態(tài)條件的地區(qū)種植。小偃22的耐寒能力相對較弱，這成為其北移擴大種植面積的限制條件。本研究采用基因槍介導(dǎo)的共轉(zhuǎn)化法，將KN2基因和篩選標記基因bar共轉(zhuǎn)化到弱冬性小麥品種小偃22中，通過除草劑篩選，獲得含有目的基因KN2的轉(zhuǎn)基因小麥植株，為進一步研究KN2基因?qū)μ岣咿D(zhuǎn)基因小麥抗寒性的作用，以及利用基因技術(shù)提高小麥抗逆性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料和載體質(zhì)粒

選用黃淮麥區(qū)大面積推廣的弱冬性小麥品種小偃22為供試材料。供試材料于2011～2012年度種植在西北農(nóng)林科技大學小麥試驗田，田間正常管理。

共轉(zhuǎn)化所用載體質(zhì)粒分別為含有目標基因KN2的載體質(zhì)粒pUBI::KN2和含有篩選標記基因bar的載體質(zhì)粒pUBI::bar，結(jié)構(gòu)見圖1，均由中國科學院遺傳與發(fā)育研究所王道文研究員提供。

圖1 載體質(zhì)粒pUBI::KN2和pUBI::bar的結(jié)構(gòu)UBI promoter.玉米泛素基因啟動子;KN2.南極魚的超氧化物歧化酶基因;bar.篩選標記基因，通過編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶來降低膦絲菌素的毒性;Nos.終止子

1.2 小麥的遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因植株的獲得

采收小偃22授粉后10 d的未成熟種子，用0.1%升汞消毒后剝?nèi)∮着撸瑢⑵涠芷辖臃N于MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+500 mg/L 酸水解酪蛋白+2.0 mg/L 2,4-D)，25 ℃暗培養(yǎng)7 d后，將愈傷組織轉(zhuǎn)入高滲培養(yǎng)基(MS+0.4 mol/L 甘露醇+500 mg/L 酸水解酪蛋白+2.0 mg/L 2,4-D)上高滲培養(yǎng)6 h，然后采用Bio-Rad公司生產(chǎn)的PDS-1000/He型基因槍進行轟擊(金粉濃度為120 μg/槍，2種質(zhì)粒濃度比為1∶1，均為1.0 μg/槍，轟擊壓力為7.584 MPa，真空度為27～28 Pa，轟擊距離為9 cm)，轟擊后的愈傷組織于高滲培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)16 h，再轉(zhuǎn)移到MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)7 d，恢復(fù)培養(yǎng)后的愈傷組織轉(zhuǎn)移至分化篩選培養(yǎng)基(MS+1.5 mg/L KT+0.05 mg/L NAA+4.0 mg/L PPT)上，25 ℃光照條件下培養(yǎng)，每2周更換1次培養(yǎng)基,將分化出的小苗轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基(1/2MS+0.2 mg/L NAA)，待苗高為4～5 cm時移至春化間春化40 d，苗高為7～8 cm時將根系發(fā)達的分化苗移栽到培養(yǎng)缽(直徑30 cm，高度50 cm)中，于溫室生長。

1.3 轉(zhuǎn)基因小麥植株的PCR檢測

取轉(zhuǎn)基因小麥植株幼嫩葉片，采用CTAB法[21]提取基因組DNA，進行PCR擴增。根據(jù)目的基因序列，采用Primer5.0軟件設(shè)計引物，KN2基因的上游引物為：5′-AGCCCCTGTGACGCTGAC-3′，下游引物為：5′-GCGATGCCGATGACTCCA-3′,擴增片段大小為396 bp。bar基因的上游引物為：5′-TGCACCATCGTCAACCACTACAT-3′,下游引物為：5′-GCTGCCAGAAACCCACGTCAT-3′,擴增片段大小為433 bp。PCR擴增體系總體積為20 μL：10×PCR buffer 2.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL，上、下游引物(稀釋成10 μmol/L)各0.5 μL，TaqDNA聚合酶 0.2 U (TianGen公司)，模板DNA約200 ng，補ddH2O至20 μL。KN2擴增程序為：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，65 ℃復(fù)性 30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。bar擴增程序為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，56 ℃復(fù)性 30 s，72 ℃延伸 50 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。以小偃22非轉(zhuǎn)基因植株作為陰性對照，以ddH2O作為空白對照，將擴增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)KN2基因小麥植株的獲得

以小偃22為轉(zhuǎn)化受體，共接種2 000個幼胚誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，7 d后產(chǎn)生的愈傷組織數(shù)為1 943個，愈傷誘導(dǎo)率為97.15 %；轉(zhuǎn)移至高滲培養(yǎng)基上的愈傷組織數(shù)為1 680個；基因槍轟擊后的愈傷組織經(jīng)過恢復(fù)培養(yǎng)和篩選分化，共獲得再生植株17株，移栽到培養(yǎng)缽中后成活15株，成活率為88.2%(圖2)。

圖2 小偃22 轉(zhuǎn)KN2基因的再生植株

2.2 轉(zhuǎn)KN2基因小麥植株的PCR鑒定

將再生植株幼苗移栽到培養(yǎng)缽在溫室培養(yǎng)，取轉(zhuǎn)基因小麥植株幼嫩葉片提取基因組DNA進行PCR檢測。經(jīng)過多次PCR檢測，非轉(zhuǎn)基因植株(陰性對照)和ddH2O(空白對照)均沒有擴增產(chǎn)物，15株再生植株中僅有6株(7號、10～14號再生植株)擴增到與陽性質(zhì)粒pUBI::bar大小一致的433 bp的目標片段(圖3-A)，表明獲得了6株轉(zhuǎn)bar基因的陽性植株，bar基因轉(zhuǎn)化率為0.36%(6/1 680)；15株再生植株中僅有4株(7號、11～13號再生植株)擴增到與陽性質(zhì)粒pUBI::KN2大小一致的396 bp的目標片段基因(圖3-B)，表明獲得了4株轉(zhuǎn)KN2的陽性植株，KN2的轉(zhuǎn)化率為 0.24%(4/1 680)； 7號、11～13號再生植株同時轉(zhuǎn)入了bar和KN2，共轉(zhuǎn)化率為 0.24%。

圖3 小偃22共轉(zhuǎn)化植株bar特異PCR(A)和KN2特異PCR(B)檢測結(jié)果

3 討 論

在轉(zhuǎn)基因研究中廣泛使用除草劑或者抗生素基因作為篩選標記基因，可以從大量的非轉(zhuǎn)化細胞中篩選出相對較少的轉(zhuǎn)化細胞，進而減輕后續(xù)試驗的工作量[22]。但是以此為篩選標記基因獲得轉(zhuǎn)基因植株后篩選標記基因的存在就是多余的，甚至是有害的，并且對篩選標記基因進行安全評估要耗費大量的人力和財力，而且結(jié)果還不易被廣大消費者接受[23]?；驑尳閷?dǎo)的共轉(zhuǎn)化法由于操作簡單，并且通過后代的自交分離能夠去除篩選標記基因，因此，該方法成為最常用的獲得無篩選標記的轉(zhuǎn)基因植物的方法。應(yīng)用該方法已經(jīng)成功獲得了水稻[24]、玉米[25]和苜蓿[26]等作物的無篩選標記基因的植株。劉永偉等[27]采用基因槍共轉(zhuǎn)化的方法成功將病毒復(fù)制酶基因Nib8和ERF轉(zhuǎn)錄因子W17導(dǎo)入揚麥12和揚麥16中，揚麥12為受體的轉(zhuǎn)化率分別為1.53%(Nib8)、4.87%(W17)和0.42%(Nib8+W17)，揚麥16為受體的轉(zhuǎn)化率分別為2.05%(Nib8)、0.86%(W17)和0.20%(Nib8+W17)。周淼平等[22]同樣采用基因槍共轉(zhuǎn)化的方法，將擬南芥DREB2A基因和bar基因?qū)氲叫←溒贩NAlondra和揚麥12中，Alondra為受體的轉(zhuǎn)化率分別為2.4%(bar)、0.2%(AtDREB2A)和0.1%(bar+AtDREB2A)，揚麥12為受體的轉(zhuǎn)化率分別為2.4%(bar)、0.6%(AtDREB2A)和0.2%(bar+AtDREB2A)。本研究利用基因槍介導(dǎo)的共轉(zhuǎn)化法,將篩選標記基因bar與目的基因KN2轉(zhuǎn)入小麥品種小偃22中，旨在獲得含有目的基因的轉(zhuǎn)基因植株，通過后代自交分離得到只含有目的基因的轉(zhuǎn)基因植株，bar的轉(zhuǎn)化率為0.36%，KN2的轉(zhuǎn)化率為 0.24%，bar和KN2的共轉(zhuǎn)化率為0.24%。這些轉(zhuǎn)基因小麥研究報道的遺傳轉(zhuǎn)化率均不相同，其主要原因之一可能是受體品種不同所致。

凍害是弱冬性小麥種植面積擴大的最大限制因素。超氧化物歧化酶(SOD)能夠清除細胞內(nèi)的活性氧，防止活性氧積累對膜造成的破壞，進而保護細胞的膜系統(tǒng)。本研究采用基因槍法，將南極魚體內(nèi)編碼超氧化物歧化酶的基因KN2和篩選標記基因bar共轉(zhuǎn)化到小麥品種小偃22中，通過多次PCR檢測篩選獲得了4株同時含有KN2和bar基因的轉(zhuǎn)基因小麥；這些轉(zhuǎn)基因小麥的目標基因是否能穩(wěn)定遺傳，以及轉(zhuǎn)基因植株的抗寒性是否比非轉(zhuǎn)基因植株有所提高，還有待對這4株轉(zhuǎn)基因植株進行后代追蹤檢測，進一步通過轉(zhuǎn)KN2和bar基因植株后代自交分離剔除bar基因，最終篩選獲得含有KN2基因的安全轉(zhuǎn)基因小麥植株，進一步研究轉(zhuǎn)KN2基因的小偃22的抗寒性變化。

志謝：感謝中國科學院遺傳與發(fā)育研究所王道文研究員為本研究提供了載體質(zhì)粒！

[參考文獻]

[1] 鄭大偉,李茂松,霍治國.2008年南方低溫冰雪災(zāi)害對農(nóng)業(yè)的影響及對策 [J].防災(zāi)科技學院學報,2008,10(2):1-4.

Zheng D W,Li M S,Huo Z G.Effects of 2008 snow disaster in southern China on agriculture and countermeasures [J].Journal of Institute of Disaster-Prevention Science and Technology,2008,10(2):1-4.(in Chinese)

[2] 郭傳貴.小麥凍害及防御措施 [J].安徽農(nóng)學通報,1998,4(4):58-59.

Guo C G.Freeze injury and defensive measures of wheat [J].Anhui Agricultural Science Bulletin,1998,4(4):58-59.(in Chinese)

[3] 葉興國,程紅梅,徐惠君,等.轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶和β-1,3葡聚糖酶雙價基因小麥的獲得和鑒定 [J].作物學報,2005,31(5):583-586.

Ye X G,Cheng H M,Xu H J,et al.Development of transgenic wheat plants with chitinase and β-1,3 glucosanase genes and their resistance to fusarium head blight [J].Acta Agronomica Sinica,2005,31(5):583-586.(in Chinese)

[4] 周淼平,周小青,張增艷,等.TaPIMP1過量表達提高轉(zhuǎn)基因小麥紋枯病抗性的研究 [J].核農(nóng)學報,2011,25(3):421-426.

Zhou M P,Zhou X Q,Zhang Z Y,et al.Over-expression ofTaPIMP1 enhanced resistance to wheat sharp eyespot in transgenic wheat [J].Journal of Nuclear Agricultural Sciences,2011,25(3):421-426.(in Chinese)

[5] 黨 良,王愛云,徐惠君,等.抗根腐病的轉(zhuǎn)GmPGIP3基因小麥揚麥18的獲得與鑒定 [J].作物學報,2012,38(10):1833-1838.

Dang L,Wang A Y,Xu H J,et al.Development and characterization ofGmPGIP3 transgenic Yangmai 18 with enhanced resistance to wheat common root rot [J].Acta Agronomica Sinica,2012,38(10):1833-1838.(in Chinese)

[6] 畢瑞明,賈海燕,封德順,等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)抗儲糧害蟲轉(zhuǎn)基因小麥(TriticumaestivumL.)的獲得和分析 [J].生物工程學報,2006,22(3):431-437.

Bi R M,Jia H Y,Feng D S,et al.Transgenic wheat (TriticumaestivumL.) with increased resistance to the storage pest obtained by agrobacterium tumefaciens mediated [J].Chinese Journal of Biotechnology,2006,22(3):431-437.(in Chinese)

[7] 張 彥,喻修道,唐克軒,等.用基因槍法獲得轉(zhuǎn)異天南星基因aha抗蚜蟲小麥 [J].作物學報,2012,38(8):1538-1543.

Zhang Y,Yu X D,Tang K X,et al.Generation of aphid resistant transgenic wheat withahafromArisaemaheterophyllumby particle bombardment [J].Acta Agronomica Sinica,2012,38(8):1538-1543.(in Chinese)

[8] 陳紅敏,陳 明,魏安智,等.抗逆相關(guān)基因GmAREB轉(zhuǎn)基因小麥的獲得和鑒定 [J].植物遺傳資源學報,2010,11(6):749-754.

Chen H M,Chen M,Wei A Z,et al.Molecular and functional analysis of transgenic wheat transformed with stress-related geneGmAREB[J].Journal of Plant Genetic Resources,2010,11(6):749-754.(in Chinese)

[9] 喻修道,徐兆師,陳 明,等.小麥轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究及其應(yīng)用 [J].中國農(nóng)業(yè)科學,2010,43(8):1539-1553.

Yu X D,Xu Z S,Chen M,et al.The progress and application of wheat transformation technology [J].Scientia Agricultura Sinica,2010,43(8):1539-1553.(in Chinese)

[10] 劉香利,金偉波,劉 縉,等.高分子量麥谷蛋白亞基基因1Bx14轉(zhuǎn)化小麥 [J].中國農(nóng)業(yè)科學,2011,44(21):4350-4357.

Liu X L,Jin W B,Liu J,et al.Transformation of wheat with high molecular weight glutenin subunit gene 1Bx14 [J].Scientia Agricultura Sinica,2011,44(21):4350-4357.(in Chinese)

[11] 王海鳳,韓 冉,張東武,等.基因槍法介導(dǎo)轉(zhuǎn)ZmalI基因小麥植株的獲得和鑒定 [J].西北農(nóng)林科技大學學報:自然科學版,2011,39(8):90-94.

Wang H F,Han R,Zhang D W,et al.Acquisition and identification of wheat withZmalIgene by biolistic particle and molecular identification [J].Journal of Northwest A&F University:Natural Science Edition,2011,39(8):90-94.(in Chinese)

[12] Hu L,Li Y,Xu W G,et al.Improvement of the photosynthetic characteristics of transgenic wheat plants by transformation with the maize C4 phosphoenolpyruvate carboxylase gene [J].Plant Breeding,2012,131(3):385-391.

[13] 康國章,岳彩鳳,沈丙權(quán),等.凍害脅迫下小麥葉片內(nèi)一些抗凍基因轉(zhuǎn)錄水平研究 [J].西北農(nóng)業(yè)學報,2010,19(2):55-59.

Kang G Z,Yue C F,Shen B Q,et al.Transcript levels of some freezing-tolerant genes in wheat leaves under field freezing stress conditions [J].Acta Agriculturae Boreali-Occidentalis Sinica,2010,19(2):55-59.(in Chinese)

[14] 劉艷陽,李俊周,陳 磊,等.低溫脅迫對小麥葉片細胞膜脂過氧化產(chǎn)物及相關(guān)酶活性的影響 [J].麥類作物學報,2006,26(4):70-73.

Liu Y Y,Li J Z,Chen L,et al.Effect of low temperature stress on peroxidation product of membrane lipids and activity of related enzymes in wheat seedling leaves [J].Journal of Triticeae Crops,2006,26(4):70-73.(in Chinese)

[15] Georges F,Saleem M,Cutler A J.Design and cloning of a synthesis gene for the flounder antifreeze protein and its expression in plant cells [J].Gene,1990,91(2):159-165.

[16] Fan Y,Liu B,Wang H,et al.Cloning of an antifreeze protein gene from carrot and its influnce on cold tolerance in transgenic tobacoo plants [J].Plant Cell Rep,2002,21:296-301.

[17] Parvanova D,Popova A,Zaharieva I,et al.Low temperature tolerance of tobacco plants transformed to accumulate proline,fructans,or glycine betaine:Variable chlorophyll fluorescence evidence [J].Photosynthetica,2004,42(2):179-185.

[18] Mckersie B D,Chen Y R,Beus M D,et al.Superoxide dismutase enhance tolerance of freezing stress in transgenic alfalfa (MedicagosativaL.) [J].Plant Physiol,1993,103:1155-1163.

[19] 郭北海,張艷敏,李洪杰,等.甜菜堿醛脫氫酶(BADH)基因轉(zhuǎn)化小麥及其表達 [J].植物學報,2000,42(3):279-283.

Guo B H,Zhang Y M,Li H J,et al.Transformation of wheat with a gene encoding for the betain aldehyde dehydrogenase(BADH) [J].Acta Botanica Sinica,2000,42(3):279-283.(in Chinese)

[20] Zhang X Y,Liang C,Wang G P,et al.The protection of wheat plasma membrance under cold stress by glycine betain overproduction [J].Biologia Plant Rum,2010,54(1):83-88.

[21] 王 敏,那冬晨,姬虎太,等.快速小量提取小麥葉片DNA的一種簡易方法 [J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2009,37(35):17384-17385.

Wang M,Na D C,Ji H T,et al.A simple and quick method of extracting genomic DNA from wheat leaf [J].Journal of Anhui Agri Sci,2009,37(35):17384-17385.(in Chinese)

[22] 周淼平,余桂紅,孫曉波,等.基因槍共轉(zhuǎn)化將擬南芥DREB2A基因和bar基因?qū)胄←?[J].江蘇農(nóng)業(yè)學報,2009,25(6):1224-1228.

Zhou M P,Yu G H,Sun X B,et al.Co-transferring ofAtDREB2Agene andbargene into wheat through microprojectile bombardment [J].Jiangsu J of Agr Sci,2009,25(6):1224-1228.(in Chinese)

[23] 李曉兵,陳彩艷,翟文學.培育具有安全選擇標記或無選擇標記的轉(zhuǎn)基因植物 [J].遺傳,2003,25(3):345-349.

Li X B,Chen C Y,Zhai W X.Breeding transgenic plants with safe or no selective markers [J].Hereditas,2003,25(3):345-349.(in Chinese)

[24] 于恒秀,陸美芳,陳秀花,等.不同轉(zhuǎn)化方法培育無抗性選擇標記轉(zhuǎn)基因水稻效率的比較 [J].中國水稻科學,2009,23(2):120-126.

Yu H X,Lu M F,Chen X H,et al.Comparison on efficiency of generating selectable marker-free transgenic rice by different transformation methods [J].Chinese Journal of Rice Science,2009,23(2):120-126.(in Chinese)

[25] Shiva P N,Bhojaraja R,Shivbachan S K,et al.Marker-free transgenic corn plant production through co-bombardment [J].Plant Cell,2009,28:1655-1668.

[26] Ferradini N,Nicolia A,Capomaccio S,et al.Assessment of simple marker-free genetic transformation techniques in alfalfa [J].Plant Cell,2011,30(11):1991-2000.

[27] 劉永偉,徐兆師,杜麗璞,等.病毒復(fù)制酶基因Nib8和ERF轉(zhuǎn)錄因子W17基因槍法共轉(zhuǎn)化小麥 [J].作物學報,2007,33(9):1548-1552.

Liu Y W,Xu Z S,Du L P,et al.Co-transferring of virus replicase geneNib8 andERFgeneW17 into wheat through microprojectile bombardment [J].Acta Agronomica Sinica,2007,33(9):1548-1552.(in Chinese)