李嘉欣，蘇 燕

（包頭醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，內(nèi)蒙古包頭014060）

包頭醫(yī)學(xué)院血紅蛋白研究室于20世紀(jì)80年代初便創(chuàng)建了淀粉-瓊脂糖混合凝膠電泳，主要用來觀察血紅蛋白的電泳行為。試驗(yàn)時(shí)不需要制備紅細(xì)胞裂解液，可直接用全血進(jìn)行電泳觀察，大大提高了研究效率。2007年，本研究組在進(jìn)行一例輕型β-地中海貧血患者的紅細(xì)胞電泳過程中偶然發(fā)現(xiàn)了血紅蛋白（hemoglobin，Hb）再釋放現(xiàn)象，并依此創(chuàng)建了血紅蛋白釋放試驗(yàn)（hemoglobin releasing test，HRT）［1-3］。紅細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白釋放試驗(yàn)是將未裂解的完整紅細(xì)胞加在淀粉-瓊脂糖混合凝膠中進(jìn)行電泳，一次通電完成電泳，此時(shí)有Hb釋放出來，稱為“初釋放”；如果在電泳釋放過程中進(jìn)行“斷電-再通電”，又會(huì)有Hb從原點(diǎn)釋放出來，稱為“再釋放”。正常情況下，初釋放時(shí)，紅細(xì)胞內(nèi)的大部分Hb都釋放出來，殘留較少；再釋放時(shí)，殘留Hb再次離開紅細(xì)胞，出現(xiàn)新的Hb區(qū)帶［2，4］。試驗(yàn)過程中，本研究組將這一技術(shù)不斷發(fā)展，并應(yīng)用于臨床病例的研究，比較了多種疾病及手術(shù)前后血液中紅細(xì)胞HRT 結(jié)果的差異，并初步探討了其臨床意義，現(xiàn)對(duì)其臨床研究進(jìn)展做一綜述。

1 紅細(xì)胞血紅蛋白電泳再釋放技術(shù)的建立與發(fā)展

根據(jù)電泳過程中停電的次數(shù)分為“單帶再釋放”和“多帶再釋放”。紅細(xì)胞“單帶再釋放”是指在電泳過程中人為停電-再通電一次，僅釋放出一個(gè)Hb區(qū)帶，由于再釋放Hb條帶的位置可通過設(shè)定再通電的開動(dòng)時(shí)間而定點(diǎn)，因此又稱為“定點(diǎn)單帶再釋放”；“多帶再釋放”是指在電泳過程中人為停電-再通電多次，則釋放出多個(gè)Hb區(qū)帶，像梯子一樣，故又稱為“梯帶再釋放”。為了消除不同樣本間上樣量的差異，試驗(yàn)中多以碳酸酐酶（carbonic anhydrase，CA）為內(nèi)對(duì)照，通過比較釋放區(qū)帶與CA 區(qū)帶掃描灰度的比值來定量［4］。

根據(jù)對(duì)全血或紅細(xì)胞處理方法的不同分為等滲再釋放、低滲再釋放和等低滲全程再釋放。等滲再釋放是指全血中的紅細(xì)胞或紅細(xì)胞樣本處于等滲的血漿或生理鹽水中；低滲再釋放是指在全血中加入不同比例的蒸餾水，使紅細(xì)胞處于低滲狀態(tài)，此時(shí)根據(jù)蒸餾水的比例不同，再釋放差異很大；等低滲全程再釋放是指同一樣本在等滲和低滲條件下同時(shí)做HRT，信息量明顯增加，能顯示出不同疾病之間的明顯差異。

根據(jù)電泳方向分為“單向再釋放”和“雙向再釋放”?！皢蜗蛟籴尫拧笔侵冈陔娪具^程中，電場(chǎng)方向不變；“雙向再釋放”是指在第一向電泳進(jìn)行一段時(shí)間后，將電場(chǎng)方向旋轉(zhuǎn)90°繼續(xù)進(jìn)行第二向電泳。為了區(qū)別于經(jīng)典的雙向電泳（等點(diǎn)聚焦-SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳），也稱之為“對(duì)角線電泳”［5-6］。這種方法避免了再釋放區(qū)帶與CA 的重疊，有利于定量分析。為了比較多個(gè)樣本間的差異，雙向電泳又分為單層（只加一個(gè)樣本）、雙層（加兩個(gè)樣本）或多層（加多個(gè)樣本）。此外，根據(jù)再釋放的電場(chǎng)方向與初釋放相同或相反又可分為“前進(jìn)型再釋放”和“后退型再釋放”。“前進(jìn)型再釋放”指初釋放時(shí)血紅蛋白向正極泳動(dòng)，停電／再通電后電極方向不變，再釋放出來的血紅蛋白繼續(xù)泳向正極方向。“后退型再釋放”指停電／再通電后，陰陽極對(duì)調(diào)，這樣再釋放的血紅蛋白就退向負(fù)極。

2 不同患者血紅蛋白釋放試驗(yàn)的比較研究

2.1 β-地中海貧血患者的血紅蛋白釋放試驗(yàn)

地中海貧血（簡(jiǎn)稱地貧）是單基因遺傳病，主要表現(xiàn)為由于珠蛋白合成障礙造成的貧血，分為α-地貧和β-地貧兩種。目前診斷地貧多采用擴(kuò)增受阻突變系統(tǒng)與聚合酶鏈反應(yīng)相結(jié)合的檢測(cè)方法。該方法準(zhǔn)確、可靠［7］，但對(duì)試驗(yàn)技能要求高，費(fèi)用高昂，不適用于臨床地貧篩查［8］。本研究小組在對(duì)一例輕型β-地中海貧血患者血紅蛋白標(biāo)本進(jìn)行單向Hb電泳分析時(shí)，意外發(fā)現(xiàn)在停電-再通電后，其Hb 釋放量明顯多于其他人。之后對(duì)輕型β-地中海貧血患者血紅蛋白標(biāo)本進(jìn)一步進(jìn)行了雙向Hb 再釋放的電泳分析，發(fā)現(xiàn)人為多次停電-再通電后，每次都釋放出Hb，并且釋放量均多于其他人，形成梯帶或竹節(jié)帶［1］。與此相反，球形紅細(xì)胞增多癥的患者HRT明顯減少（待發(fā)表）。這提示，紅細(xì)胞內(nèi)絕大多數(shù)未與細(xì)胞膜結(jié)合Hb在第一次電泳時(shí)就釋放出來，推測(cè)還有部分Hb與膜結(jié)合，在隨后的停電-再通電后（再釋放）才能逐步釋放出來，釋放量可能與疾病相關(guān)。近期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)［9］，不同濃度戊二醛處理紅細(xì)胞后會(huì)降低Hb釋放，原因與戊二醛引起紅細(xì)胞膜磷脂與胞內(nèi)外蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)有關(guān)，據(jù)此研究人員推測(cè)HRT 中再釋放的Hb 可能是與細(xì)胞膜結(jié)合的Hb；另外，用不同濃度過氧化氫處理紅細(xì)胞后會(huì)增加Hb再釋放，這可能是由于膜脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致更多Hb與膜結(jié)合［10］。

2.2 普通外科患者血紅蛋白釋放試驗(yàn)

研究小組抽取18例普通外科住院患者靜脈血，分別進(jìn)行等滲室溫HRT、等滲37 ℃HRT（即電泳前先將血液標(biāo)本在37 ℃保溫12h）及低滲37 ℃HRT 等3種HRT 定點(diǎn)釋放，染色后觀察血紅蛋白釋放情況。在等滲室溫HRT 中（8例血液標(biāo)本），有1例陽性；在等滲37 ℃HRT 中（10例血液標(biāo)本），有3例陽性，其血液標(biāo)本分別來自膽石癥、腸梗阻和脾破裂患者；而在低滲37 ℃HRT 中（10例血液標(biāo)本同上），有5例陽性，其血液標(biāo)本除來自膽石癥、腸梗阻、脾破裂患者外，還有膽總管結(jié)石和化膿性闌尾炎患者。試驗(yàn)結(jié)果顯示各種水平HRT 的靈敏度不同：低滲37 ℃HRT 高于等滲37 ℃HRT，等滲37℃HRT 高于等滲室溫HRT。靈敏度不同，可能揭示不同層次的問題。等滲室溫HRT 時(shí)，多數(shù)臨床標(biāo)本不出現(xiàn)陽性，一旦釋放增強(qiáng)，可能預(yù)示病情加重［11］。對(duì)不同患者的HRT 分析發(fā)現(xiàn)，同一疾病來源的血液標(biāo)本并非總是陽性結(jié)果，提示HRT 的改變除與疾病相關(guān)外，可能更與其代謝異常相關(guān)。對(duì)于出現(xiàn)陽性結(jié)果的血液標(biāo)本，是血漿中某種成分發(fā)生改變對(duì)HRT 產(chǎn)生了影響，還是紅細(xì)胞膜成分發(fā)生改變對(duì)HRT 產(chǎn)生了影響，都是需要進(jìn)一步深入研究的問題。

2.3 慢性腎衰竭患者的血紅蛋白釋放試驗(yàn)

慢性腎衰竭（chronic renal failure，CRF）是各種原發(fā)性或繼發(fā)性慢性腎疾患導(dǎo)致腎功能損害所出現(xiàn)的一系列癥狀和代謝紊亂組成的臨床綜合征［12］。本研究首先利用低滲HRT 五管法（使用蒸餾水對(duì)血液進(jìn)行5種不同程度的稀釋）研究了CRF 患者與正常人紅細(xì)胞HRT 的差異。結(jié)果顯示，CRF 患者低滲HRT 與正常對(duì)照組相比出現(xiàn)異常，當(dāng)水∶血為7∶3時(shí)，差異更為明顯。此外，研究者還利用低滲37 ℃HRT 一管法（水∶血為8∶2）比較了5例CRF與4例非CRF腎病患者的血紅蛋白釋放，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CRF患者的白蛋白前移和血紅蛋白釋放均強(qiáng)于非CRF腎病患者，這可能是由于CRF 患者血中多種毒素對(duì)紅細(xì)胞膜的作用［13］。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這種推測(cè)，研究者觀察了CRF患者的血漿成分對(duì)非CRF腎病患者紅細(xì)胞HRT 的影響，結(jié)果顯示CRF患者的血漿成分似乎能夠影響紅細(xì)胞的血紅蛋白釋放［13］。CRF產(chǎn)生的毒素有3類，即水溶性物質(zhì)，不與蛋白質(zhì)結(jié)合的小分子物質(zhì)，中分子物質(zhì)和能與蛋白質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)。已知中分子物質(zhì)甲狀旁腺素能增加紅細(xì)胞內(nèi)鈣含量，進(jìn)而影響其完整性，破壞紅細(xì)胞［14］，而能與蛋白質(zhì)結(jié)合的毒素是否會(huì)作用于紅細(xì)胞并影響HRT，有待于進(jìn)一步研究確認(rèn)。

2.4 肝硬化患者血紅蛋白釋放試驗(yàn)

本研究共篩查了38例全血標(biāo)本的HRT，發(fā)現(xiàn)一例肝功能多項(xiàng)異常的肝硬化伴腹水標(biāo)本的HRT異常。然后研究小組利用等低滲全程試驗(yàn)和雙層對(duì)角線電泳技術(shù)，比較了肝硬化患者和肝功正常血液標(biāo)本的HRT，發(fā)現(xiàn)了明顯不同。肝硬化患者標(biāo)本的“前進(jìn)”和“后退”再釋放都增強(qiáng)。選取電泳效果最明顯的等低滲標(biāo)本（水∶全血為14∶6）做對(duì)角線電泳，可清楚看到Hb后退成分的存在，說明肝硬化患者紅細(xì)胞中Hb的存在狀態(tài)明顯異常，前進(jìn)再釋放釋放很多Hb后，后退再釋放又釋放出較多Hb［15］。肝硬化患者紅細(xì)胞的細(xì)胞膜、形態(tài)、聚集性等都發(fā)生了很大變化，血小板參數(shù)和紅細(xì)胞參數(shù)存在明顯異常，血細(xì)胞破壞增加，有明顯的出血傾向［16］，這些可能都會(huì)影響到HRT。肝硬化腹水是肝臟長期慢性進(jìn)展性損害的結(jié)果，是肝硬化進(jìn)入中晚期（失代償期）的標(biāo)志［17］。今后需要進(jìn)一步比較肝硬化不同時(shí)期患者的HRT，為進(jìn)一步揭開HRT 的發(fā)生機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

2.5 糖尿病患者的血紅蛋白釋放試驗(yàn)

為了研究血糖濃度對(duì)HRT 的影響，研究小組選取10例糖尿病患者的血液標(biāo)本，分別做全血和紅細(xì)胞的Hb梯帶再釋放。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，全血釋放幾乎沒有梯帶，而紅細(xì)胞釋放有梯帶且與血糖濃度相關(guān)。為了進(jìn)一步研究血糖與HRT 的關(guān)系，研究小組觀察了等體積50、100、500g／L 的葡萄糖溶液作用正常紅細(xì)胞后的HRT。結(jié)果顯示，葡萄糖能使紅細(xì)胞的梯帶再釋放明顯增強(qiáng)，且隨著血糖濃度增大梯帶再釋放遞增［18］。糖尿病是以慢性血葡萄糖水平增高為特征的代謝性疾病［19］。研究表明，糖尿病病人的高糖狀態(tài)能夠改變正常血液環(huán)境，導(dǎo)致血液流變學(xué)異常、紅細(xì)胞形態(tài)改變，進(jìn)而導(dǎo)致紅細(xì)胞變形能力下降［20-21］，這樣也可能會(huì)影響紅細(xì)胞的HRT。此外，糖尿病患者往往血脂增高，是否也會(huì)影響紅細(xì)胞的HRT 還有待于進(jìn)一步研究。

2.6 剖宮產(chǎn)前后血紅蛋白釋放試驗(yàn)

本研究選取一例剖宮產(chǎn)孕婦，分別于剖宮產(chǎn)術(shù)前、術(shù)后1、5、13d采血，然后將4 份血液標(biāo)本進(jìn)行多層對(duì)角線電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)后5d標(biāo)本在HbA1前方出現(xiàn)聯(lián)苯胺染色陽性成分。接著選取術(shù)后5d標(biāo)本進(jìn)行等低滲全程電泳，并對(duì)術(shù)后1d和5d的血液標(biāo)本進(jìn)行單向再釋放。結(jié)果顯示，術(shù)后5d標(biāo)本出現(xiàn)聯(lián)苯胺染色陽性成分和白蛋白前麗春紅染色陽性成分［22］。推測(cè)白蛋白前的麗春紅染色陽性成分應(yīng)為前白蛋白。前白蛋白為肝臟合成的一種“急性期反應(yīng)蛋白質(zhì)”，半衰期很短，僅約1.9d。聯(lián)苯胺染色陽性成分應(yīng)為血紅蛋白與結(jié)合珠蛋白的復(fù)合物，珠蛋白也是由肝臟合成的急性期反應(yīng)蛋白，半衰期約為3.5d～4d。這兩種陽性反應(yīng)物質(zhì)的出現(xiàn)，是對(duì)剖宮產(chǎn)手術(shù)的一種急性期反應(yīng)。而是否手術(shù)不同，急性期反應(yīng)蛋白出現(xiàn)天數(shù)不同，或其出現(xiàn)是否與不同患者的身體狀態(tài)相關(guān)，則需要進(jìn)一步深入研究。

3 展望

目前，HRT 初步的臨床研究結(jié)果顯示很多患者均可以出現(xiàn)HRT 增加，雖然沒有找到其共同的規(guī)律，但可以初步確定血紅蛋白再釋放的改變與紅細(xì)胞的改變有關(guān)。然而，影響紅細(xì)胞狀態(tài)的因素有很多，除了成分復(fù)雜多樣的血漿外，血液流變學(xué)（包括紅細(xì)胞變形性和聚集性）的改變也會(huì)影響紅細(xì)胞［23］。那么，什么原因會(huì)改變血紅蛋白釋放？血紅蛋白釋放是否具有疾病特異性？這些問題都需要進(jìn)一步的深入研究，從而為闡明血紅蛋白釋放的分子機(jī)制及其與疾病的關(guān)系奠定理論基礎(chǔ)，為紅細(xì)胞及Hb相關(guān)疾病的臨床診斷和治療提供新的依據(jù)。

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