樊淑華，王永立

（周口師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院，河南周口466001）

膠體金免疫層析技術(shù)（colloidal gold immunochromatography assay，GICA）是以膠體金做為示蹤物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。自1971年Faulk W P和Taylor G M［1］首次創(chuàng)立膠體金免疫層析技術(shù)在大腸埃希菌應(yīng)用以來(lái)，該技術(shù)已成為繼熒光標(biāo)記、酶標(biāo)記和放射性免疫標(biāo)記之后的又一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。本文綜述了近4年來(lái)膠體金免疫層析技術(shù)在動(dòng)物疾病檢測(cè)、毒物及藥物殘留、重金屬離子監(jiān)測(cè)等方面的最新研究進(jìn)展。

1 膠體金免疫層析技術(shù)在疾病監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用

在應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)檢測(cè)動(dòng)物病毒中基本都采用雙抗體夾心法。該方法多用膠體金標(biāo)記單克隆抗體作為捕捉抗體（capture antibody，cAb），可與樣品中的抗原特異性結(jié)合；將另一株單克隆抗體（或多抗）包被檢測(cè)線作為檢測(cè)抗體（detection antibody，dAb），用抗標(biāo)記單克隆抗體的多抗包被質(zhì)控線作為質(zhì)控抗體（control antibody）以檢測(cè)試紙條的有效性。當(dāng)待檢樣本中含有檢測(cè)抗原時(shí)，在檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)兩條肉眼可見(jiàn)的紅色條帶，反之則僅在質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條紅色條帶。該技術(shù)廣泛應(yīng)用于動(dòng)物病毒性疫病、動(dòng)物細(xì)菌性疾病及人畜共患病的監(jiān)測(cè)中。

1.1 膠體金免疫層析技術(shù)在病毒性疾病監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用

膠體金免疫層析技術(shù)在動(dòng)物病毒性疾病，特別是在豬圓環(huán)病毒、口蹄疫病毒及豬瘟病毒等病毒的檢測(cè)中應(yīng)用廣泛。如Jin Q 等［2］采用重組核衣殼蛋白作為檢測(cè)抗原建立了檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型（PCV-2）的膠體金免疫層析方法，并采用該方法和商品化ELISA 試劑盒分別對(duì)500 份臨床血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，其符合率為94%。表明該方法具有良好的特異性和敏感性。Jiang T 等［3］以豚鼠抗口蹄疫病毒（FMDV）的多抗作為捕捉抗體，以兔抗FMDV 的多抗為檢測(cè)抗體，羊抗豚鼠的二抗作為質(zhì)控抗體建立了檢測(cè)FMDV A 亞型的雙抗體夾心免疫層析方法，該方法與其他亞型FMDV、豬水皰病病毒、豬水皰性口炎病毒之間均無(wú)交叉反應(yīng)，其檢測(cè)極限為11.7ng／mL。臨床檢測(cè)結(jié)果表明，該方法與雙抗體夾心ELISA 方法具有一致的敏感性和特異性，且操作簡(jiǎn)單快速，15min內(nèi)能夠得出檢測(cè)結(jié)果，是一種適合于臨床檢查的快速診斷方法。Li X 等［4］在大腸埃希菌BL21中表達(dá)豬瘟病毒（CSFV）E0 和E2 蛋白主要抗原域，以純化的嵌合蛋白（CnC2）為抗原建立了快速檢測(cè)豬瘟血清中CSFV 疫苗抗體滴度的免疫膠體金試紙條。該研究以嵌合蛋白作為捕捉抗原，以SPA 和抗CnC2 的單克隆抗體分別包被檢測(cè)線和質(zhì)控線，研制的試紙條與商業(yè)化的ELISA 試劑盒的檢測(cè)符合率為93.5%，敏感性和特異性分別為97.0% （65／67）、100% （98／98），特別適合于豬瘟抗體滴度的大范圍臨床監(jiān)測(cè)。除采用病毒蛋白作為檢測(cè)抗原外，Yang S等［5］還發(fā)明了一種基于合成肽技術(shù)的免疫膠體金試紙條，該研究從FMDV 非結(jié)構(gòu)蛋白中篩選了一條能夠與FMDV 感染豬血清發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng)，而不能與疫苗接種豬血清發(fā)生反應(yīng)的多肽，并以該多肽作為檢測(cè)抗原，研制出能夠區(qū)別O型口蹄疫病毒感染豬與疫苗免疫豬的膠體金試紙條，該試紙條與商業(yè)化Ceditest（R）ELISA 和UBI（R）ELISA 試劑盒的符合率分別為98.59% 、96.63%，并具有良好的特異性和敏感性。另外，膠體金免疫層析技術(shù)在其他動(dòng)物病毒性疾病如魚(yú)類(lèi)疾病的檢測(cè)中也應(yīng)用廣泛，如Sheng X Z 等［6］研制了檢測(cè)魚(yú)淋巴囊腫病毒（Lymphocystis disease virus，LCDV）快速檢測(cè)試紙條，該研究采用抗LCDV 的兩種單克隆抗體2D11和1A8分別作為捕捉抗體和檢測(cè)抗體，以羊抗鼠的二抗為質(zhì)控抗體組裝試紙條，與商業(yè)化試紙條和點(diǎn)印跡法的平行檢測(cè)證明該方法具有很高的特異性和敏感性，極限檢測(cè)值為1 μg／mL，室溫下可保存6個(gè)月，4 ℃能保存12個(gè)月，具有較高的穩(wěn)定性。

近年來(lái)，人畜共患病頻發(fā)，危害日趨嚴(yán)重，如不同亞型的禽流感病毒引發(fā)的高死亡率及存在人與人之間傳染的潛在可能性，使這些病原的快速、特異的檢測(cè)方法的建立成為迫切需要。而膠體金免疫層析技術(shù)不僅具有較強(qiáng)的特異性，而且檢測(cè)迅速，不需要特殊的儀器設(shè)備，特別適用于疾病現(xiàn)場(chǎng)的大規(guī)模檢測(cè)。如Miyoshi Akiyama T 等［7］以抗H1N1亞型流感病毒NP蛋白的單克隆抗體為捕捉抗體，建立了特異性檢測(cè)2009年H1N1亞型大流感（AH1pdm）的膠體金試紙條。試驗(yàn)表明，該試紙條能夠特異性檢測(cè)AH1pdm，且不與季節(jié)性H1N1、H3N2 亞型和B型流感病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，具有較強(qiáng)的特異性；采用該方法和PCR 方法平行對(duì)臨床分離的5份人AH1pdm 樣品進(jìn)行檢測(cè)，兩種方法檢測(cè)結(jié)果一致且都為陽(yáng)性，說(shuō)明該試紙條具有較強(qiáng)的敏感性。Kang K等［8］采用抗血凝素（HA）的特異單克隆抗體建立了檢測(cè)2013年H7N9亞型禽流感的免疫層析方法。該方法檢測(cè) H7N9 流感病毒的最低檢測(cè)極限為103TCID50，能夠從重組HA 抗原中特異檢測(cè)H7亞型，包括H7N9和H7N7亞型病毒，不會(huì)與其他亞型如H1N1、H3N2、H5N1、H5N9和H9N1亞型發(fā)生交叉反應(yīng)。對(duì)病人（RT-PCR 方法確診）的檢測(cè)敏感性為59.4%（19／32），對(duì)陽(yáng)性唾液樣品的檢測(cè)敏感性為61.5%（16／26），對(duì)180份陰性樣品的檢測(cè)中未出現(xiàn)假陽(yáng)性，說(shuō)明該方法具有較好的特異性。這些免疫層析方法的建立對(duì)于流感的防控起到了積極的預(yù)防作用。

1.2 膠體金免疫層析技術(shù)在細(xì)菌性疾病監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用

膠體金免疫層析技術(shù)也廣泛應(yīng)用于動(dòng)物細(xì)菌性疾病的檢測(cè)中，如用于豬鏈球菌、兔土拉桿菌等病原的檢測(cè)。Ju Y 等［9］研制了出檢測(cè)豬2 型鏈球菌的膠體金試紙條，該方法的檢測(cè)敏感度高達(dá)106CFU／mL，與其他血清型的鏈球菌（除SS1／2型以外，因SS1／2與2型鏈球菌具有相同的抗原決定簇）無(wú)交叉反應(yīng)。Kilic S等［10］研制出檢測(cè)野兔熱土拉桿菌的膠體金試紙條，與微量凝集試驗(yàn)結(jié)果相比，該方法的敏感性和特異性分別為99.3% 和94.6%。該方法在檢測(cè)正常血清樣品，自身免疫性疾病及細(xì)菌、病毒和寄生蟲(chóng)感染的血清學(xué)樣品時(shí)均無(wú)交叉反應(yīng)。Moongkarndi P等［11］建立了快速檢測(cè)鼠傷寒沙門(mén)菌和腸炎沙門(mén)菌的的膠體金方法，該研究分別使用了抗鼠傷寒和抗腸炎沙門(mén)菌兩種單克隆抗體，與特異性識(shí)別鼠傷寒的單克隆抗體組裝成了雙夾心的試紙條。該試紙條能夠快速檢測(cè)培養(yǎng)基中的鼠傷寒沙門(mén)菌和腸炎沙門(mén)菌，檢測(cè)極限分別為104和106CFU／mL。臨床檢測(cè)結(jié)果表明，該方法檢測(cè)鼠傷寒和腸炎沙門(mén)菌的敏感性分別為98.89% （89／90）和87.50% （70／80）。與商業(yè)化的檢測(cè)方法相比，該試紙條的特異性為100%，且該試紙條是首個(gè)同時(shí)檢測(cè)兩種不同的沙門(mén)菌的膠體金方法，為養(yǎng)雞場(chǎng)和其他肉制品的大批量檢測(cè)提供了一種簡(jiǎn)單、快速的檢測(cè)手段。Shukla S 等［12］建立了一種基于脂質(zhì)體的免疫膠體金方法，該方法使用熒光染料磺酰羅丹明B標(biāo)記免疫脂質(zhì)體（脂質(zhì)體與親和純化的羊抗沙門(mén)菌IgG 的多克隆抗體），分別將羊抗沙門(mén)菌IgG 的多克隆抗體和兔抗羊的IgG 作為檢測(cè)抗體和質(zhì)控抗體，結(jié)果表明，該方法的檢測(cè)極限為102CFU／mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于商業(yè)化試紙條的檢測(cè)極限（107CFU／mL）。另外，膠體金免疫層析技術(shù)在細(xì)菌性人畜共患病的檢測(cè)中也得到了進(jìn)一步應(yīng)用，如在霍亂弧菌、金黃色葡萄球菌及結(jié)核分支桿菌的檢測(cè)中，霍亂弧菌是引起霍亂的一種食源性致病菌，人類(lèi)常因誤食海鮮制品而患病。Pengsuk C等［13］建立并評(píng)估了檢測(cè)海鮮制品中霍亂弧菌O139 的免疫試紙條，該試紙條使用了抗霍亂弧菌脂多糖和莢膜多糖的兩種單克隆抗體，即VC-273 和VC-812；其中VC-273作為捕捉抗體噴涂在玻璃纖維上與樣品墊相連，VC-812和羊抗鼠的IgG 分別作為檢測(cè)抗體和質(zhì)控抗體噴涂于硝酸纖維素膜上。評(píng)估試驗(yàn)表明，該試紙條的檢測(cè)敏感性為104CFU／mL，且將檢測(cè)樣品在堿性蛋白胨水中孵育12h后其檢測(cè)極限可達(dá)到1 CFU／mL。金黃色葡萄球菌也是一種重要的人畜共患致病菌，同時(shí)也是奶牛乳腺炎的主要致病菌之一，人類(lèi)常由于誤食污染的牛乳而導(dǎo)致食物中毒。布日額等［14］研制了檢測(cè)牛乳中致病性金黃色葡萄球菌的膠體金試紙條，檢測(cè)結(jié)果表明該試紙條具有較好的特異性、敏感性和穩(wěn)定性。Wassie L 等［15］研制了一種快速診斷臨床肺結(jié)核桿菌的免疫層析試紙條，該研究首先通過(guò)ELISA 方法篩選到一組能夠被肺結(jié)核病人血清識(shí)別但不與對(duì)照組血清反應(yīng)的抗原，再將這些抗原按照免疫層析方法進(jìn)行組裝，并用組裝的試紙條對(duì)來(lái)自埃塞俄比亞（肺結(jié)核高發(fā)國(guó)家）和土耳其（地方流行區(qū)）臨床上不同健康狀況（包括肺結(jié)核感染病人、密切接觸病人及健康對(duì)照組）人群的血清樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，該方法特異性高達(dá)97%以上，但對(duì)肺結(jié)核的敏感性?xún)H為46%～54%。雖然該方法在臨床診斷中敏感性不高，但具有較高的特異性，可為臨床檢測(cè)提供參考。Mdluli P 等［16］利用改進(jìn)的雙通道膠體金免疫層析技術(shù)建立了檢測(cè)肺結(jié)核抗體的膠體金試紙條。該試紙條能夠更有效的檢測(cè)全血和血清樣品中的結(jié)核分支桿菌抗體，且該試驗(yàn)中采用ESE 讀數(shù)儀對(duì)檢測(cè)線抗體的濃度進(jìn)行了半定量化，使檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確可信。

2 膠體金免疫層析技術(shù)在食品藥物殘留檢測(cè)中的應(yīng)用

膠體金免疫層析技術(shù)在食品藥物殘留中的檢測(cè)不僅包括對(duì)抗生素殘留、磺胺類(lèi)藥物殘留等方面［17］的檢測(cè)，還包括對(duì)三聚氰胺、黃曲霉毒素及地高辛等治療藥物殘留的檢測(cè)。Byzova N A 等［18-19］建立了檢測(cè)牛奶中氯霉素和鏈霉素的免疫層析試紙條，并對(duì)其敏感性和穩(wěn)定性進(jìn)行了優(yōu)化，氯霉素的檢測(cè)極限值為10ng／mL。鏈霉素的檢測(cè)與傳統(tǒng)ELISA 方法符合率在93%以上。另外，Byzova N A 等［20］還建立了檢測(cè)動(dòng)物源性食品中氧氟沙星的免疫層析方法。氧氟沙星的檢測(cè)極限值為30ng／mL，符合食品安全評(píng)估的需要，臨床檢測(cè)結(jié)果表明該方法不僅能夠檢測(cè)牛奶中的氧氟沙星，而且能夠檢測(cè)雞肉和豬肉樣品中殘留的氧氟沙星。Gong Y 等［21］建立了快速檢測(cè)三聚氰胺的膠體金方法，該研究采用抗三聚氰胺的單克隆抗體為檢測(cè)抗體，檢測(cè)極限值為50 mg／L。該方法可用于牛奶、奶粉、肉制品中三聚氰胺的檢測(cè)，其中牛奶的檢測(cè)極限值為100 mg／L，奶粉為100ng／g，其他食品為200ng／g。與質(zhì)譜方法相比，免疫層析法更適用于大量奶制品中三聚氰胺的檢測(cè)。Gao S等［22］建立了快速檢測(cè)食品中相思豆毒素的免疫層析方法，該試紙條由鼠抗相思豆毒素A 鏈的單克隆抗體和兔抗相思豆毒素的多克隆抗體組裝而成，該方法可在10 min內(nèi)得出檢測(cè)結(jié)果，最低檢測(cè)極限為3ng／mL，且與其他相關(guān)的毒素?zé)o交叉反應(yīng)。

為解決目前免疫層析方法檢測(cè)黃曲霉毒素B1（AFB1）選擇性較差的問(wèn)題，Zhang D 等［23］建立了一種新的檢測(cè)黃曲霉毒素的免疫層析法，該研究采用了兩種特異性更強(qiáng)的單克隆抗體，其中抗黃曲霉毒素B的單克隆抗體AFB（2a）-BSA 和其他文獻(xiàn)報(bào)道中采用的AFB（1）-BSA 抗體相比，具有更高的特異性，很好的避免了樣品檢測(cè)過(guò)程中假陽(yáng)性的出現(xiàn)；對(duì)天然污染的樣品如花生、普洱茶、植物油、飼料等農(nóng)產(chǎn)品的檢測(cè)結(jié)果表明，該方法與高效液相色譜法結(jié)果一致，可作為農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素檢測(cè)的常用方法。

Omidfar K 等［24］建立了監(jiān)測(cè)病人血液中地高辛的納米膠體金檢測(cè)方法，該技術(shù)可在5min內(nèi)完成對(duì)地高辛的定量檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)間比放射免疫檢測(cè)縮短了近20 倍～30 倍，肉眼觀察檢測(cè)敏感度為2ng／mL，該濃度在治療過(guò)程中地高辛有毒濃度以?xún)?nèi)，血清樣品檢測(cè)的敏感度和精確度與放射免疫測(cè)定法結(jié)果一致。因此，該方法可作為快速檢測(cè)血液樣品中地高辛的一種新手段。

3 膠體金免疫層析技術(shù)在重金屬離子檢測(cè)中的應(yīng)用

隨著工業(yè)化程度的不斷發(fā)展，許多重金屬離子持續(xù)污染水資源，對(duì)環(huán)境和人類(lèi)健康造成了嚴(yán)重的危害。雖然有些重金屬離子如銅、鋅、鉻、錳等為人類(lèi)必需的微量元素，但過(guò)量攝取也會(huì)導(dǎo)致機(jī)體中毒。目前重金屬離子的檢測(cè)方法有火焰原子吸收光譜、液液萃取、分光光度法、化學(xué)發(fā)光法等，但這些方法不僅需要昂貴的設(shè)備，而且費(fèi)時(shí)費(fèi)力。免疫層析法不僅具有較強(qiáng)的敏感性和特異性，而且便于操作，因此也廣泛用于重金屬離子的檢測(cè)。Liu X［25］建立了檢測(cè)水和血清樣品中Cr3＋和Cr6＋的納米金層析方法，該方法以親和純化的抗螯合劑isothiocyanobenzyl-EDTA（iEDTA）單克隆抗體作為檢測(cè)抗體，使用0～80ng／mL的鉻離子標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明該方法的最低檢測(cè)限為50.0ng／mL，且能夠?qū)ρ鍢悠分械你t離子進(jìn)行檢測(cè)。該試紙條37 ℃條件下存放12周后，不影響其生物學(xué)活性，與其他重金屬離子無(wú)交叉反應(yīng)。說(shuō)明該試紙條具有一定的穩(wěn)定性和較強(qiáng)的特異性。免疫層析試紙條攜帶方便、檢測(cè)迅速，特別適用于鉻離子污染水的大量檢測(cè)及鉻離子的生物監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。牡蠣是一種鉻含量較高的食物，Nishi K 等［26］建立了檢測(cè)牡蠣中鉻離子的膠體金方法。該研究首先使用0.1mol／L HCl從牡蠣中提取鉻離子，采用陰離子交換法去除其他離子。隨后采用電感耦合等離子分析技術(shù)檢測(cè)5種金屬離子Mn、Fe、Cu、Zn和Cd的含量。檢測(cè)結(jié)果表明，使用HCl能夠提取牡蠣中大多數(shù)的鉻離子，且采用陰離子交換法去除其他離子的過(guò)程中不會(huì)造成鉻離子的損失。該方法檢測(cè)結(jié)果與電感耦合等離子質(zhì)譜法的一致率為97%。表明該技術(shù)是一種可靠的檢測(cè)牡蠣中鉻離子的實(shí)用方法。Tang Y 等［27］建立了快速檢測(cè)水中鉛離子的免疫膠體金方法，該方法的最低檢測(cè)限為50ng／mL。與電感耦合等離子質(zhì)譜檢測(cè)平行檢測(cè)結(jié)果表明，該方法具有較強(qiáng)的特異性和敏感性，是一種能夠應(yīng)用于水中鉛離子場(chǎng)地快速檢測(cè)的實(shí)用方法。水銀是水中最危險(xiǎn)的一種污染品，低濃度即能對(duì)環(huán)境和人類(lèi)健康造成嚴(yán)重危害。Zhou Y 等［28］建立了檢測(cè)水中汞離子的競(jìng)爭(zhēng)免疫層析方法，該方法可在15min內(nèi)快速檢測(cè)水中的Hg2＋，且不需對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜的樣品前處理，不需要精密的儀器和設(shè)備。

4 展望

膠體金免疫層析技術(shù)是一種新型檢測(cè)方法，具有簡(jiǎn)單快速、結(jié)果清晰，無(wú)需復(fù)雜的操作技巧和特殊設(shè)備及攜帶方面等優(yōu)點(diǎn)。已成為臨床快速診斷領(lǐng)域發(fā)展的一個(gè)新方向。但由于只能用于定性或半定量的檢測(cè)，難以滿(mǎn)足臨床檢測(cè)指標(biāo)定量化的要求，且靠肉眼判斷檢測(cè)結(jié)果，存在靈敏度較低等問(wèn)題，需要進(jìn)一步完善。新型膠體金免疫層析技術(shù)在以上問(wèn)題上進(jìn)行了改進(jìn)，克服了上述不足。Zhou G 等［29］將棉線等材料引入免疫層析技術(shù)中，用棉線和尼龍纖維束代替樣品墊和硝酸纖維素膜。并且將棉線和尼龍纖維束進(jìn)行打結(jié)形成框架結(jié)構(gòu)，從而實(shí)現(xiàn)了多個(gè)樣品的高通量檢測(cè)。不僅如此，該方法還采用平板掃描儀對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行定量分析，克服了免疫層析法無(wú)法定量的缺點(diǎn)。而最新發(fā)展的免疫層析技術(shù)以特有的光電磁信號(hào)放大系統(tǒng)、親和素-生物素放大技術(shù)提高檢測(cè)靈敏度，減少樣品的本底干擾。如熒光乳膠層析技術(shù)，在原有免疫層析基礎(chǔ)上，在纖維膜上預(yù)包被彩色熒光乳膠標(biāo)記的抗原或抗體，可應(yīng)用于免疫分析儀檢測(cè)熒光信號(hào)，擁有傳統(tǒng)標(biāo)記物所無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)。總之，免疫層析分析技術(shù)在滿(mǎn)足檢測(cè)快速而簡(jiǎn)便的前體下，若能夠進(jìn)一步提高檢測(cè)的特異度和靈敏度，減少假陰性和假陽(yáng)性，實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)，必能夠在基層臨床檢測(cè)中發(fā)揮更大的作用。

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