王傳旭

(運(yùn)城學(xué)院 生命科學(xué)系，山西 運(yùn)城 044000)

家蠶(BombyxmoriLinaeus)屬于昆蟲綱鱗翅目蠶蛾科，為完全變態(tài)昆蟲。家蠶作為鱗翅目昆蟲研究中的代表生物，在昆蟲的生長發(fā)育和害蟲防治等研究領(lǐng)域都有著不可比擬的優(yōu)勢(shì)。2003年成功繪制家蠶基因組框架圖,2006年研制成功了世界上第一張覆蓋家蠶全基因組的寡核苷酸芯片。家蠶基因組和表達(dá)組分析平臺(tái)的建立，為我們從基因組和基因水平上研究家蠶提供了良好的基礎(chǔ)[1]。

蠶病是桑蠶養(yǎng)殖中的大敵，直接影響蠶繭的產(chǎn)量及質(zhì)量。家蠶致病的因素有生物因素如病原菌感染，環(huán)境因素如不良的光照、溫度或者氣體等，化學(xué)因素如農(nóng)藥毒物，物理因素如機(jī)械損傷，飼料因素如葉片質(zhì)量差，體質(zhì)因素如品種差異、蠶種帶毒等[2]，其中生物因素是家蠶致病最主要的原因。

了解家蠶免疫系統(tǒng)是解決蠶病的基礎(chǔ)。對(duì)家蠶免疫相關(guān)基因的研究，不僅可以使人們更加詳細(xì)地了解家蠶免疫應(yīng)答的分子調(diào)控機(jī)制，還可以促進(jìn)人們對(duì)昆蟲的分子調(diào)控機(jī)制的深入理解，為昆蟲免疫分子的多樣性研究提供線索[3]。在漫長的進(jìn)化過程中，家蠶形成了一套高效的先天性免疫系統(tǒng)以抵御外界微生物的感染。先天性免疫是無脊椎和脊椎動(dòng)物的重要免疫防御陣線，其通過模式受體蛋白(pattern recognition receptors，PRR)識(shí)別病原微生物表面的病原相關(guān)分子模式(pathogen assoeiated molecular pattems，PAMPs)[4,5]。病原相關(guān)分子模式是宿主昆蟲體內(nèi)不存在的物質(zhì)，它代表的是一種分子模式。PAMPs是一類不以蛋白質(zhì)為主要組分的生物大分子，主要包括脂多糖、肽聚糖、脂磷壁、葡聚糖和甘露聚糖等[6，7]。這些大分子容易被先天免疫系統(tǒng)識(shí)別[8]。

模式識(shí)別受體是生物體先天免疫系統(tǒng)中免疫受體的代表，對(duì)生物體的生存極為重要[9]。昆蟲的先天免疫系統(tǒng)中，肽聚糖識(shí)別蛋白(peptidoglycan recognition proteins, PGRPs)作為模式識(shí)別受體在識(shí)別入侵病原物和激活免疫調(diào)控途徑中起著重要作用[10～14]。1996年，Yoshida等人從家蠶血液中純化得到一種具有信號(hào)肽、等電點(diǎn)為6.5、分子量為19 kDa的PGRPs，也是生物界最早從昆蟲中得到的小型肽聚糖識(shí)別蛋白。該蛋白存在于家蠶的血淋巴和表皮中，對(duì)肽聚糖和革蘭氏陽性菌具有較高的結(jié)合活性，體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明該肽聚糖識(shí)別蛋白在結(jié)合肽聚糖以后可以激活酚氧化酶原系統(tǒng)[15]，之后又在其他的昆蟲和哺乳動(dòng)物中克隆出肽聚糖識(shí)別蛋白基因[16]，它們都具有一個(gè)大小約165個(gè)氨基酸的保守的PGN結(jié)合結(jié)構(gòu)域。目前在果蠅中發(fā)現(xiàn)13個(gè)該家族的基因，并且至少編碼17個(gè)蛋白[17]，在按蚊中發(fā)現(xiàn)7個(gè)該家族的基因，共編碼9個(gè)蛋白[18]。人類含有4種PGRP基因[19]。昆蟲的血細(xì)胞、脂肪體和中腸等免疫器官中肽聚糖識(shí)別蛋白都可表達(dá)，且大多能被PGN或細(xì)菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，表明其在抗菌反應(yīng)中起到重要作用[8]。

天蠶素(Cecropin)最先是在1981年從注射過細(xì)菌的惜古比天蠶滯育蛹中分離得到的，是一類對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌都有很好抗菌活性的陽離子抗菌肽，具有很好的藥物開發(fā)潛能[20]。Cecropin A是最早發(fā)現(xiàn)的抗菌肽之一，由35個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，其N端堿性很強(qiáng)，螺旋結(jié)構(gòu)，N端序列對(duì)其活性具有重要作用，使Cecropin具有廣譜的抗菌活性[21]。

目前對(duì)PGRP和Cecropin基因的研究主要集中于其在革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的免疫作用上，而對(duì)這2個(gè)基因在細(xì)菌和真菌的免疫中的作用少有涉及。因此，利用代表性的細(xì)菌(金黃色葡萄球菌)和真菌(白色念珠菌)對(duì)家蠶進(jìn)行免疫刺激，以期得到PGRP和Cecropin這2個(gè)基因在家蠶不同組織中的免疫模式。

1 材料與方法

1.1 材料

家蠶由運(yùn)城市蠶業(yè)科學(xué)研究院提供。幼蟲在室溫23℃下桑葉喂食。桑葉是從運(yùn)城學(xué)院東門桑樹采摘的新鮮嫩葉。所用菌種為金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)和白色念珠菌(Moniliaalbican)，由運(yùn)城學(xué)院李新提供。

1.2 方法

1.2.1 家蠶處理

1.2.1.1 取樣

取過夜培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌和白色念珠菌各1 mL，離心后分別將沉淀用0.5 mL滅菌PBS(10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, pH 7.4，稀釋至0.1 mg·mL-1)重懸備用。

1.2.1.2 注射

選取3齡、蛻皮后20～24 h家蠶作為試驗(yàn)材料，每只家蠶注射5 μL病原菌，對(duì)照組選取3齡蛻皮后20～24 h家蠶注射等體積的滅菌PBS，于注射后1，3，6和12 h分別提取不同處理下家蠶中腸和脂肪體總RNA。每種處理均為6只家蠶。

1.2.2 家蠶中腸和脂肪體總RNA的提取

使用北京全式金公司Trans Zol試劑盒，按照說明書提取處理后的家蠶中腸和脂肪體總RNA，測定OD值，并用瓊脂糖凝膠電泳分析檢測提取的RNA的質(zhì)量。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄

使用TakaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒，以O(shè)ligo dT為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，具體實(shí)驗(yàn)步驟按照說明書進(jìn)行，獲得第一鏈cDNA。

1.2.4 RT-PCR引物設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)中所需要的引物均采用Oligo 6軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)(表1)。引物合成由生工生物工程(上海)有限公司完成。

1.2.5 半定量RT-PCR檢測

采用半定量RT-PCR的方法，測定家蠶幼蟲在分別注射金黃色葡萄球菌和白色念珠菌1，3，6和12 h后中腸和脂肪體內(nèi)PGRP基因和Cecropin基因的轉(zhuǎn)錄水平。半定量RT-PCR采用家蠶看家基因胞質(zhì)肌動(dòng)蛋白β-Actin做內(nèi)參，以cDNA為模板，利用表1對(duì)應(yīng)的引物進(jìn)行擴(kuò)增。PCR程序如下：94℃預(yù)變性5 min；94℃，45 s；53℃，30 s；72℃，45 s；循環(huán)32次；72℃延伸10 min后4℃保存。每個(gè)樣品重復(fù)3次以上。PCR后樣品利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用Tanon Gis軟件分析電泳結(jié)果。

表1 RT-PCR引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌和白色念珠菌對(duì)PGRP基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

以β-Actin為內(nèi)參基因，對(duì)白色念珠菌和金黃色葡萄球菌分別感染的家蠶中腸和脂肪體中PGRP基因進(jìn)行半定量RT-PCR檢測，結(jié)果見圖1。

由圖1可以看出，與對(duì)照組(注射滅菌PBS)相比，白色念珠菌感染的家蠶中腸和脂肪體中PGRP基因的轉(zhuǎn)錄水平較低，與對(duì)照相比轉(zhuǎn)錄幾乎沒有變化(圖1A)。

金黃色葡萄球菌感染的家蠶中腸和脂肪體中PGRP基因的轉(zhuǎn)錄水平變化比較明顯，但在不同的組織中，PGRP的轉(zhuǎn)錄模式有少許不同：中腸中，PGRP對(duì)金黃色葡萄球菌響應(yīng)較快，在刺激后1 h轉(zhuǎn)錄即出現(xiàn)明顯的上調(diào)，并且上調(diào)可以持續(xù)至12 h(圖1A)；脂肪體中，PRGP基因?qū)瘘S色葡萄球菌的響應(yīng)較慢，在刺激3 h后轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有變化但刺激6 h后，其轉(zhuǎn)錄水平明顯開始上升，至刺激12 h后轉(zhuǎn)錄水平繼續(xù)增強(qiáng)(圖1B)。

圖1 家蠶中腸和脂肪體PGRP基因在白色念珠菌(真菌)或金黃色葡萄球菌(細(xì)菌)刺激后的轉(zhuǎn)錄變化Fig.1 The transcription pattern of B.mori midgut gene PGRP after the challenge of C.albicans(fungi) and S.aureus(bacteria).注：PBS為對(duì)照。圖2同。Note:PBS was the control.The same as Fig.2.

2.2 金黃色葡萄球菌和白色念珠菌對(duì)Cecropin基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

以β-Actin為內(nèi)參基因，對(duì)白色念珠菌和金黃色葡萄球菌分別感染的家蠶中腸和脂肪體中Cecropin基因進(jìn)行半定量RT-PCR檢測，結(jié)果見圖2。由圖2可以看出，與對(duì)照組(注射滅菌PBS)相比，白色念珠菌感染的家蠶中腸中Cecropin基因的轉(zhuǎn)錄水平較低，與對(duì)照相比轉(zhuǎn)錄幾乎沒有變化；金黃色葡萄球菌刺激后，中腸中的Cecropin基因在刺激后3 h轉(zhuǎn)錄開始上調(diào)并持續(xù)至刺激后12 h(圖2A)。

脂肪體中的Cecropin基因在白色念珠菌刺激后3 h和6 h后出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄上調(diào)，在刺激12 h后趨于平穩(wěn)。同對(duì)照組相比，在金黃色葡萄球菌刺激后，脂肪體中的Cecropin基因的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有明顯變化(圖2B)。

圖2 家蠶中腸和脂肪體Cecropin基因在白色念珠菌(真菌)或金黃色葡萄球菌(細(xì)菌)刺激后的轉(zhuǎn)錄變化Fig.2 The transcription pattern of B.mori midgut and fatbody gene Cecropin after the challenge of C.albicans (fungi) and S.aureus(bacteria).

3 討論與結(jié)論

(1)PGRP可以響應(yīng)革蘭氏陽性細(xì)菌引起的免疫反應(yīng)，對(duì)革蘭氏陽性真菌沒有免疫反應(yīng)。金黃色葡萄球菌是典型的革蘭氏陽性細(xì)菌，白色念珠菌是典型的革蘭氏陽性真菌。PGRP是昆蟲先天免疫中的重要的模式識(shí)別受體，當(dāng)革蘭氏陽性菌入侵昆蟲時(shí)，Imd通路上游的PGRP作為模式識(shí)別受體來識(shí)別革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁中的賴氨酸型肽聚糖，從而啟動(dòng)Imd通路的表達(dá)[11]。試驗(yàn)結(jié)果證明了PGRP只能啟動(dòng)革蘭氏陽性細(xì)菌引起的免疫反應(yīng)，對(duì)革蘭氏陽性真菌沒有明顯的免疫反應(yīng)?？赡苁怯捎诮瘘S色葡萄球菌是典型的革蘭氏陽性菌，PGRP能夠輕松的識(shí)別細(xì)菌表面的肽聚糖；白色念珠菌雖然也是革蘭氏陽性菌，但染色時(shí)著色不均勻，說明細(xì)胞表面肽聚糖分布不均勻，故不易被PGRP所識(shí)別。

(2)Cecropin在昆蟲不同組織對(duì)細(xì)菌和真菌的刺激反應(yīng)不同。Cecropin是昆蟲中的一類重要的抗菌肽。Cecropin是螺旋的線性抗菌肽，通過在微生物細(xì)胞膜上形成離子通道使得微生物胞內(nèi)物質(zhì)泄漏產(chǎn)生抗菌活性。Cecropin家族對(duì)革蘭氏陰性菌有強(qiáng)抗菌活性，對(duì)革蘭陽性菌的抗性較弱[20]。Cecropin家族在家蠶體內(nèi)分布具有組織特異性，在脂肪體和血淋巴中表達(dá)量很高，而馬氏管、中腸、絲腺等組織器官幾乎不表達(dá)[21]。

結(jié)果顯示Cecropin基因在家蠶的中腸和脂肪體中都有轉(zhuǎn)錄活性，在受到不同的病原菌的刺激后都可以引起轉(zhuǎn)錄上調(diào)。在中腸中，轉(zhuǎn)錄活性較弱一些，主要是對(duì)細(xì)菌的刺激具有免疫反應(yīng)；在脂肪體中，轉(zhuǎn)錄活性相對(duì)強(qiáng)一些，主要針對(duì)真菌的刺激具有免疫反應(yīng)。

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