孫葉迎，陳麗飛，劉樹(shù)英，劉 昕，曹 巖，劉洪章

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) a 生命科學(xué)學(xué)院，b 園藝學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

杓蘭屬(Cypripedium)是蘭科的一個(gè)屬，多年生草本植物[1]。杓蘭屬植物最顯著的特征是其花唇瓣特化成兜狀，因此，有人稱之為“大口袋花”。杓蘭屬植物低垂的花瓣酷似拖鞋，生活在終年云霧繚繞、遍地野花的高山上，也被稱為“仙女的拖鞋”，西方人美其名曰“l(fā)ady’s slipper”，即拖鞋蘭[2]。此屬植物花形奇特，顏色艷麗，株型優(yōu)雅多姿，觀賞價(jià)值極高，深受園藝學(xué)家們的喜愛(ài)，并將收集杓蘭屬植物作為目標(biāo)[3]。杓蘭屬的地理分布式樣較杓蘭亞科中其他4個(gè)屬?gòu)?fù)雜[1,4]。50余種杓蘭屬植物廣泛分布在北半球溫帶和亞熱帶山地，東亞和北美為主要的分布中心[1,5]。我國(guó)杓蘭屬植物種類繁多，資源豐富，被稱作杓蘭資源多樣性中心[6-7]。據(jù)《中國(guó)植物志》記載，中國(guó)有杓蘭屬植物32種及1個(gè)變種，近年來(lái)報(bào)道或正式命名的新品種有4個(gè)[8-11]，共36種，1個(gè)變種，其中21種及1變種是我國(guó)的特有種。據(jù)《東北植物檢索表》記載，東北地區(qū)分布的杓蘭屬植物有大花杓蘭、斑花杓蘭、杓蘭和黃鈴杓蘭4個(gè)種及大白花杓蘭1個(gè)變型[12]。長(zhǎng)白山地區(qū)除了上述杓蘭屬植物外還有東北杓蘭、山西杓蘭，但在長(zhǎng)白山地區(qū)，甚至東北地區(qū)均未見(jiàn)黃鈴杓蘭的模式標(biāo)本植物[13]。目前，杓蘭屬植物由于遭破壞性采挖加之其繁育困難，造成其種群數(shù)量下降，已處于嚴(yán)重瀕危狀態(tài)[14]，被列入《野生動(dòng)植物瀕危物種國(guó)際貿(mào)易公約》的保護(hù)范圍[1,15-16]。種群內(nèi)遺傳多樣性的丟失會(huì)導(dǎo)致物種對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)性降低，增加了滅絕的危險(xiǎn)，所以，對(duì)于幸存的瀕危物種而言，研究其遺傳多樣性，對(duì)瀕危物種的管理保護(hù)及遺傳多樣性的評(píng)定至關(guān)重要[3,17-18]。

ISSR(Inter simple sequence repeats)又稱簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間，是由Zietkiewicz等[19]創(chuàng)建的新型分子標(biāo)記技術(shù)。它是在SSR分子標(biāo)記的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的，與SSR分子標(biāo)記相比無(wú)需知道DNA序列的信息；重復(fù)性好，克服了RAPD分子標(biāo)記不穩(wěn)定的缺點(diǎn)。在真核生物中，微衛(wèi)星DNA分布廣泛，且變異速度快，利用ISSR引物對(duì)微衛(wèi)星DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增，能夠快速檢測(cè)出差異位點(diǎn)，因此ISSR標(biāo)記在植物遺傳育種研究中得到廣泛應(yīng)用。但在杓蘭屬植物的研究中尚未見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)長(zhǎng)白山區(qū)不同花色的杓蘭屬植物進(jìn)行研究探討，對(duì)其遺傳多樣性以及親緣關(guān)系進(jìn)行分析，全面掌握長(zhǎng)白山區(qū)現(xiàn)有杓蘭屬種質(zhì)資源的遺傳多樣性，減少育種工作中親本選擇的盲目性，提高育種效率，以期更好地對(duì)瀕危物種進(jìn)行保護(hù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料采自于長(zhǎng)白山區(qū)，分別為大花杓蘭(CypripediummacranthumSw.)、東北杓蘭(Cypripedium×ventricosumSw.)、杓蘭(CypripediumcalceolusL.)、山西杓蘭(CypripediumshanxienseS.C.Chen)4個(gè)種，以萼片顏色區(qū)分，共8個(gè)顏色11個(gè)個(gè)體，具體如表1所示。于2012-06采集各種植物新鮮葉片置于冰盒中帶回，于-80 ℃低溫冰箱保存。

表 1 供試杓蘭屬植物材料的概況

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA提取及質(zhì)量檢測(cè) 采用CTAB法[20-21]提取4種植物11個(gè)個(gè)體的基因組DNA，并用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA質(zhì)量，凝膠成像系統(tǒng)(UVP GelDoc-ItTM型)照相，保存。再用Bi-PHotomete(EPpendor公司)核酸檢測(cè)儀測(cè)定OD260/OD280及OD260/OD230，檢測(cè)DNA樣品的純度與濃度。

1.2.2 ISSR-PCR擴(kuò)增與電泳 試驗(yàn)用哥倫比亞大學(xué)報(bào)道的植物通用的ISSR引物和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的引物[22-23]，均由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，共37個(gè)。從中篩選擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性高、重現(xiàn)性好的引物，參考不同引物的退火溫度，采用梯度PCR確定每個(gè)引物的退火溫度。擴(kuò)增反應(yīng)在PCR(德國(guó)Eppendorf Mastercycler personal)擴(kuò)增儀上進(jìn)行。ISSR反應(yīng)體系25 μL：1.5 μL DNA模板(20 ng/μL)，1.5 μL 引物(10 μmol/L)，2 μL dNTP (2.5 mmol/L，寶生物工程 (大連) 有限公司)，2.5 μL 10×PCR buffer，0.15 μLTaqDNA聚合酶(5 U/μL，寶生物工程 (大連) 有限公司)；17.35 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性1 min；55～57 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃ 15 min終止反應(yīng)。所得產(chǎn)物用60 g/L聚丙烯酰胺凝膠電泳(1×TBE)檢測(cè)，560 V電壓電泳1 h，再用體積分?jǐn)?shù)10%醋酸溶液固定30 min，銀染10 min，強(qiáng)堿顯影直至條帶清晰，照相，觀察擴(kuò)增結(jié)果。所有試驗(yàn)均重復(fù)2次。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用聚丙烯酰胺凝膠對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離后，對(duì)電泳圖進(jìn)行人工讀帶。其中每條帶視為1個(gè)分子標(biāo)記[21]，即1個(gè)引物的結(jié)合位點(diǎn)，以250 bp DNA ladder 為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)重復(fù)性好的條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，無(wú)論強(qiáng)弱有則記為1，無(wú)則記為0，模糊不清的條帶也記為0。將數(shù)據(jù)輸入數(shù)據(jù)矩陣，使用NTSYS-pc軟件對(duì)不同花色杓蘭屬植物之間的相似系數(shù)進(jìn)行分析，采用UPGMA法分析樣品間的遺傳關(guān)系，進(jìn)行聚類分析。用Popgene32軟件[24]分析觀測(cè)的等位基因數(shù)(na)、有效等位基因數(shù)(ne)、Nei’s基因多樣性(He)、Shannon信息指數(shù)(Ho)和遺傳距離。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR-PCR引物篩選及擴(kuò)增

隨機(jī)選取3份供試材料作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，在37個(gè)引物中篩選出14個(gè)條帶清晰、具有差異的引物；再用這14個(gè)引物分別對(duì)11份材料進(jìn)行復(fù)篩，最終確定擴(kuò)增效果較好的11個(gè)引物(表2)。引物UBC835對(duì)11個(gè)個(gè)體的DNA擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。經(jīng)統(tǒng)計(jì)11個(gè)引物共擴(kuò)增出94條條帶，平均每個(gè)引物獲得8.5條條帶，其中多態(tài)性條帶為86條，多態(tài)基因位點(diǎn)比例為 91.5%(表2)。

表 2 對(duì)11份杓蘭屬植物材料擴(kuò)增效果好的ISSR引物序列及多態(tài)性分析

圖 1 引物UBC835對(duì)11份杓蘭屬植物材料的ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 杓蘭屬植物的ISSR特異性標(biāo)記

圖2、3分別為引物UBC844、UBC856對(duì)11分杓蘭屬植物材料基因組DNA的擴(kuò)增結(jié)果。本研究中，11條引物共產(chǎn)生了9條特異性條帶，具有特異性條帶的植物樣品見(jiàn)表3。由表3可以看出，深粉色大花杓蘭B3和栗色的杓蘭B7特異性標(biāo)記最多，各有3條；紫紅色杓蘭B5、粉紅色大花杓蘭B6、紫紅色東北杓蘭B10各有1條特異性條帶。

圖 2 引物UBC844對(duì)11份杓蘭屬植物材料的ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖 3 引物UBC856對(duì)11份杓蘭屬植物材料的ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果

表 3 杓蘭屬植物的ISSR特異性標(biāo)記樣品

2.3 杓蘭屬植物的遺傳多樣性

表4顯示，11份材料的平均有效等位基因數(shù)為1.418 2，平均Nei’s基因多樣性為0.250 0，平均Shannon信息指數(shù)為0.369 7。其中Nei’s基因多樣性最大值為0.500 0，最小值為0.000 0；Shannon信息指數(shù)最大值為0.693 1，最小值為0.000 0，可見(jiàn)，各位點(diǎn)遺傳多樣性程度存在較大差別。

表 4 不同花色杓蘭屬植物材料的遺傳多樣性

續(xù)表 4 Continued table 4

2.4 杓蘭屬植物的遺傳距離和相似系數(shù)

11份材料的遺傳距離和遺傳相似系數(shù)見(jiàn)表5。表5顯示，樣本間的遺傳距離為0.010 5～0.969 7，其中B4大花杓蘭(淺粉紅色)與B6東北杓蘭(粉白色)之間的遺傳距離最小，為0.010 5；B4大花杓蘭(淺粉紅色)與B5杓蘭(紫紅色)及B9山西杓蘭(褐色)與B10東北杓蘭(紫紅色)的遺傳距離均最大，為0.969 7。

表 5 不同花色杓蘭屬遺植物的遺傳距離(對(duì)角線以下)和相似系數(shù)(對(duì)角線以上)

2.5 杓蘭屬植物的聚類分析

圖5為8個(gè)不同花色11個(gè)杓蘭屬植物個(gè)體的ISSR聚類圖。在相似系數(shù)為0.62時(shí)，將11個(gè)材料分為2類，4種顏色的大花杓蘭分為一類，另一類為2種花色的杓蘭、東北杓蘭、山西杓蘭以及紫紅色杓蘭變型。相似系數(shù)為0.66時(shí)，將第1類中的粉紅色大花杓蘭單分為一組；第2類中分為2組：2種花色的杓蘭與2種花色的東北杓蘭分為一組，2種花色山西杓蘭與杓蘭變型分為一組。

圖 4 11個(gè)杓蘭屬植物的聚類分析結(jié)果

3 討 論

3.1 杓蘭屬植物的遺傳多樣性

本研究結(jié)果表明，長(zhǎng)白山區(qū)杓蘭屬植物的多態(tài)基因位點(diǎn)比例為91.5%，平均Nei’s基因多樣性(He)為0.250 0，平均Shannon信息指數(shù)(Ho)為0.369 7，表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性。Takeshi等[3]對(duì)日本禮文島瀕危大花杓蘭的遺傳多樣性研究結(jié)果表明，禮文島的大花杓蘭具有較高的遺傳多樣性，多態(tài)基因位點(diǎn)比例為62%，觀測(cè)的等位基因數(shù)為1.85，有效等位基因數(shù)為1.28，Nei’s基因多樣性為0.187，Shannon信息指數(shù)為0.163，較長(zhǎng)白山區(qū)杓蘭屬植物遺傳多樣性低；Brzosko等[25]研究表明，C.calceolus的遺傳多樣性(多態(tài)基因位點(diǎn)比例為46%，觀測(cè)的等位基因數(shù)為1.73，Nei’s基因多樣性為0.156，Shannon信息指數(shù)為0.184)也比長(zhǎng)白山區(qū)杓蘭屬植物低。而蔡凝楓等[26]采用RAPD標(biāo)記對(duì)云南中甸黃花杓蘭的遺傳多樣性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其多態(tài)基因位點(diǎn)比例為82.69%，Nei’s基因多樣性為0.288 4，Shannon信息指數(shù)為0.431 2；Michael等[27]發(fā)現(xiàn),歐洲西北部杓蘭的多態(tài)基因位點(diǎn)比例為82.5%，觀測(cè)的等位基因數(shù)為1.278，Nei’s基因多樣性為0.40～0.53?？梢?jiàn)以上地區(qū)杓蘭屬植物均較長(zhǎng)白山區(qū)杓蘭屬植物的遺傳多樣性高。推斷野生杓蘭屬資源遭到破壞的主要原因是人類的濫采濫挖，對(duì)其進(jìn)行保護(hù)可從以下2點(diǎn)入手： 1)建立自然保護(hù)區(qū)，加強(qiáng)對(duì)其生境的保護(hù)，禁止濫采濫挖，尤其是商業(yè)性質(zhì)的采集；2)生境破壞嚴(yán)重的地區(qū)可以進(jìn)行遷地保護(hù)。

3.2 杓蘭屬植物的聚類分析

杓蘭屬植物隸屬于蘭科杓蘭屬，與其他蘭科植物一樣，都是單子葉植物，雜交范圍寬，種間甚至屬間都能雜交。蘭科植物多適應(yīng)蟲媒傳粉，花部特征都表現(xiàn)出高度適應(yīng)和特化，在自然雜交中變異性大，種間種類很多，種的界限不清楚，一般多依照形態(tài)學(xué)分類。本研究采用ISSR分子標(biāo)記方法，對(duì)長(zhǎng)白山區(qū)8種不同花色11個(gè)杓蘭屬植物個(gè)體進(jìn)行了分類，結(jié)果顯示，分子標(biāo)記的分類結(jié)果與形態(tài)學(xué)的分類結(jié)果存在一定程度的一致性，大白花杓蘭B2是大花杓蘭的一個(gè)變型，其花唇瓣與萼片顏色都為純白色。由聚類結(jié)果可知，大白花杓蘭與淺粉紅色的大花杓蘭B1關(guān)系更近，在聚類圖上處于同一分支，這與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果一致；而東北杓蘭是杓蘭與大花杓蘭的天然雜交種，花型在形態(tài)上更接近于大花杓蘭，但卻與杓蘭聚為一類，由此可見(jiàn)，東北杓蘭與杓蘭的關(guān)系更為密切。杓蘭變型(B8)植物中，其每株植株上具有2朵花，萼片顏色為紫紅色，花唇瓣顏色為黃色，具有褐色斑點(diǎn)，顏色與杓蘭相似；此外，其上面花朵的下萼片淺裂，下面花朵的下萼片深裂，與山西杓蘭相似，可見(jiàn)B8是介于杓蘭與山西杓蘭之間的一個(gè)變型，但在有關(guān)的文獻(xiàn)中并無(wú)記載，是一個(gè)新類型，本研究將其暫定為杓蘭變型，聚類結(jié)果顯示其與山西杓蘭聚為一類，可見(jiàn)其與山西杓蘭的親緣關(guān)系更近一些，是山西杓蘭的一個(gè)變型。

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