何 龍，高江平

解放軍醫(yī)學院 解放軍總醫(yī)院泌尿外科，北京 100853

腎細胞癌(renal cell carcinoma，RCC)簡稱腎癌，是一類起源于腎小管上皮細胞的惡性腫瘤[1]，我國腎癌的發(fā)病率估計為4/10萬左右，高發(fā)年齡為60～70歲[2,3]。與許多其他惡性腫瘤一樣，腎癌發(fā)病的早期無特異的臨床癥狀，約1/3患者確診時已發(fā)展為晚期，腎癌是對化療藥不敏感且極易發(fā)生耐藥的惡性腫瘤，一般腫瘤化療藥物的有效率僅為7%～10%[4]。晚期轉(zhuǎn)移性腎癌預后差，其中位生存期為6～12個月，5年生存率低于10%[5]。目前用于治療轉(zhuǎn)移性腎細胞癌的藥物，主要針對的是血管生成因子和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路[6]，但其療效有限。因此，在腎細胞癌的早期診斷上，臨床上需要一種新的分子標志物，能夠簡便地進行風險評估，為患者選擇更積極的治療方式。miRNAs是由約22個核苷酸組成的非編碼小RNA，它參與了許多細胞的生理病理過程[7]。miRNAs具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)功能，能調(diào)控信使RNA(mRNA)的翻譯。目前的一些研究表明，miRNAs參與了許多與腎細胞癌相關(guān)的生物學過程[8]。本文對miRNAs在腎細胞癌的發(fā)病機制等方面的研究結(jié)果進行綜述，探討其作為新的診斷和預后標志物的可能性，以及如何將這些小分子作為腎癌生物治療的最終靶點。

1 miRNAs與腎細胞癌病理生理過程的關(guān)聯(lián)

1.1 調(diào)節(jié)機制 在多項研究中，通過人為干預調(diào)節(jié)miRNAs在腎細胞癌中的表達，發(fā)現(xiàn)miRNAs對異常細胞的作用是多種多樣的。同一個miRNA可以針對多個mRNA，而多個miRNAs可以控制相同的分子，現(xiàn)在的結(jié)果尚難以準確地分析出單一miRNA對某個特定靶向基因及癌癥的影響[9]。例如，miR-17-5p和miR-224靶向調(diào)節(jié)缺氧誘導因子1(HIF-1α)和VHL蛋白(Von Hippel- Landau protein)，使其在70%的腎細胞癌中呈現(xiàn)低表達水平[10]。此外，miR-17-5p的表達，與它的兩個靶向基因，血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)和EGL9同源物3(EGL nine homolog 3,EGLN3)的表達呈負相關(guān)。對miR-224來說，其表達也同時與它的兩個靶向基因—Smad4(Sma and Madrelated protein 4)和Smad5—的表達呈負相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，相關(guān)致癌的miRNAs干擾與VHL-HIF-1α信號級聯(lián)。例如，miR-92和VHL mRNA表達呈負相關(guān)[11]。在腎透明細胞癌中，miR-138靶向調(diào)節(jié)HIF-1α并抑制其表達，并進一步影響腫瘤細胞的凋亡和轉(zhuǎn)移過程[12]。此外，HIF-1α的堆積與miR-210的上調(diào)有關(guān)。 miR-210的表達通過下調(diào)E2F轉(zhuǎn)錄因子3(E2F transcription factor 3，E2F3)來誘導中心體和DNA異倍體擴增，這種機制可能有助于腫瘤的發(fā)生和進展[13]。在另一項研究中，氨甲酰白蛋白—一種未知生物功能的蛋白代謝產(chǎn)物，被認為可能通過刺激miR-146a/b的表達參與了腎細胞癌的發(fā)病過程。雖然多數(shù)研究表明在腎細胞中miR-146a/b通常呈現(xiàn)高表達，但它們的具體作用機制尚不清楚[14]。

1.2 細胞增殖 細胞不受控制地生長是癌癥的重要標志之一， 在一些腎細胞癌的研究中miRNAs已被證實能夠改變細胞的增殖狀態(tài)。例如，腫瘤抑制因子miR-1285在腎細胞癌中呈現(xiàn)低表達，并通過靶向基因轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2(transglutaminase 2，TGM2)影響細胞的增殖[15]。miR-199a在59%的腎細胞癌中呈現(xiàn)低表達，調(diào)節(jié)miR-199a的表達能夠下調(diào)糖原合酶激酶3b(glycogen synthase kinase 3b ，GSK3b)的表達。GSK3b是腎細胞癌的生長促進劑，miR-199a通過靶向調(diào)節(jié)GSK3b的表達抑制腎癌細胞的生長[16]。另一個參與細胞增殖過程的miRNA是miR-205，它在大部分腎細胞癌中呈現(xiàn)低表達。miR-205表達上調(diào)，通過靶向癌基因磷酸肉瘤(phospho-sarcoma，SRC)酪氨酸激酶，調(diào)節(jié)細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1和2(extracellular signal-regulated kinase 1 and 2，ERK1 / 2)通路，抑制細胞增殖[17]。miR-21已被廣泛證實是許多類型癌癥的致癌基因，體外研究中，在多種腎癌細胞株中抑制其表達，均可表現(xiàn)出顯著的抗增殖效應[18]。胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1，IGF1)是由幾個miRNAs靶向調(diào)控的，VEGFA是miR-126的靶向基因。這兩個因子是細胞增殖的正向調(diào)節(jié)因子，通過靶向調(diào)節(jié)其表達，可以影響這些腫瘤的生物學特性[19]。

1.3 細胞遷移和侵襲 癌基因TGM2在腎癌組織中廣泛表達，是miR-1285的靶向基因，與細胞的遷移和侵襲相關(guān)[19]。miR-34a通過抑制骨髓細胞瘤病毒癌基因同源物(myelocytomatosis viral oncogene homolog，MYC)的表達，抑制MYCS-功能期激酶相關(guān)蛋白2(MYC S-phase kinase-associated protein 2，Skp2)與Myc相關(guān)鋅指蛋白1(Myc-associated zinc-finger protein 1，Miz1)結(jié)合，激活Ras同源基因家族因子A(Ras homolog gene family,member A,RhoA)與c-Myc陽性轉(zhuǎn)錄延伸因子b(c-Myc-positive transcription elongation factor,P-TEFb)結(jié)合，抑制腎癌細胞的侵襲[20]。57%不同表達的miRNAs擁有相同細胞簇的靶向基因，從而在轉(zhuǎn)移性腎癌的進展過程中產(chǎn)生協(xié)同效應。VEGF、HIF-1α、血小板源性生長因子β(platelet-derived growth factor-beta，PDGF-β)、PDGFC、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)、雙微體2同源基因(murine double mimute2，MDM2)和胸苷酸合成酶(thymidylate synthase，TYMS)，它們在轉(zhuǎn)移性腎透明細胞癌中是多個miRNAs失調(diào)的協(xié)同靶向基因[19]。體內(nèi)實驗證實，miR-215的過度表達能夠誘導細胞遷移和侵襲，這一過程是通過調(diào)節(jié)靶向調(diào)節(jié)蛋白鋅指E盒結(jié)合同源盒蛋白2(zinc finger E box-binding homeobox 2，ZEB2)和上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)來影響腎癌細胞的轉(zhuǎn)移潛能[21]。在腎癌組織中miR-708表達大多呈低水平，其靶向基因為ZEB2和多梳環(huán)指基因1(polycomb ring finger oncogene 1，BMI1)，這些蛋白通常在癌組織中呈現(xiàn)高表達，并可影響腫瘤細胞的上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程。miR-708通過對ZEB2和BMI1的調(diào)控來影響細胞的遷移和侵襲，同時誘導E-cadherin的表達和抑制纖維連接蛋白的表達[22]。

1.4 細胞凋亡和細胞周期 通過miR-199的過表達下調(diào)GSK3b的表達，抑制X染色體連接凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis,XIAP)和抗凋亡的B細胞慢性淋巴細胞白血病/淋巴瘤2(antiapoptotic B-cell chronic lymphatic leukemia/lymphoma 2，BCL-2)的表達水平，是由核因子-κ輕鏈增強活化B細胞介導的(nuclear factor kappa-light-chain enhancer of activated B-cells，NF -κB)[16]。重組miR-708表達能夠通過裂解腎癌細胞株中的caspase-7和caspase-3誘導細胞凋亡，這一誘導過程是通過腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡配體(NF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)的受體介導的。miR-708的促凋亡功能可能主要是通過介導細胞平衡調(diào)節(jié)器(survivin)，調(diào)節(jié)細胞死亡、細胞周期和細胞存活[22]。通過在腎癌細胞中調(diào)控miR-205的表達，來降低細胞周期蛋白D1(cyclin D1)和c-Myc的表達水平，從而將細胞阻滯在G0/G1期，并誘導其凋亡[17]。在腎細胞癌中，miR-21的幾個靶向基因在調(diào)節(jié)腫瘤進展過程中起著關(guān)鍵的作用，在體外研究中，通過細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1s(cyclin-dependent kinase inhibitor 1S，cdkn1s或P21)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)的上調(diào)，以及細胞周期蛋白E2(cyclin E2)減少，抑制miR-21，使G0/G1期細胞比例增加。此外，減少miR-21的表達抑制腫瘤壞死因子受體超家族成員6(TNF receptor superfamily member 6，F(xiàn)as)配體的表達和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子3(tissue inhibitor of metalloproteinase 3，TIMP3)，從而提示miR-21的抗凋亡作用[18,23]。脯氨酸氧化酶(Proline oxidase，POX)是一種線粒體腫瘤抑制基因，通過線粒體產(chǎn)生的活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)和抑制HIF-1信號誘導細胞凋亡。在腎細胞癌中，POX很難被檢測到，因為它是癌基因miR-23b的靶向基因，由于miR-23b的高表達抑制了POX的表達水平[24]。

2 miRNAs與腎癌診斷

由于臨床影像技術(shù)的不斷進步，越來越多的早期腎細胞癌被發(fā)現(xiàn)。然而，許多早期的腎細胞癌難以與非惡性腎臟病變區(qū)別，這可能會導致不正確的診斷結(jié)果和不必要的手術(shù)。腎細胞癌成功切除后，患者的術(shù)后監(jiān)測主要依賴于影像技術(shù)和臨床癥狀的評估，缺乏足夠的特異性和敏感性。因此，為提高早期診斷的準確性以及預后評估的可靠性，臨床上需要新的生物標志物作為早期診斷和疾病的復發(fā)或轉(zhuǎn)移的腫瘤標志物。它能夠在血液或尿液中被檢測到，并具有較高的特異性和敏感性。miRNAs具有很大的潛力成為臨床上可以運用的生物標志物，因為其在幾種常見體液中的表達是穩(wěn)定的，并且可以采用簡易和相對便宜的標準定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應法(standard quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction qRT-PCR)進行檢測[25]。有研究已經(jīng)對血清miRNAs水平在腎癌診斷中的意義進行探討。例如，循環(huán)中的miR-1233可能作為腎細胞癌的潛在生物標志物，但目前的結(jié)果多數(shù)為病理標本中miR-1233的表達水平，與臨床的關(guān)聯(lián)有限[26]。腎癌亞型分類特性具有很高的臨床重要性，因為各亞型有不同的預后和治療方法[27]。在這種情況下，應該指出的是，基于miRNAs的表達和虛擬核型分析腎細胞癌的分類，能夠使用少量的miRNAs區(qū)分最常見的四種類型成人腎腫瘤[28]。應用miRNAs標志物，與臨床相結(jié)合，逐步建立診斷決策，鑒別腎細胞癌亞型之間(透明細胞，乳頭狀和嫌色細胞)和嗜酸細胞瘤。當形態(tài)學評估不足以進行診斷，采用該方法對小的活檢樣本進行診斷是非常有應用價值的[29]。在腎細胞癌中這種生物學標志物，包括影響轉(zhuǎn)移發(fā)展的幾個關(guān)鍵分子，有可能用于鑒別腫瘤是否具有高轉(zhuǎn)移性，從而進一步指導正確的治療方案[19]。作為診斷和治療的常規(guī)組成部分，特異性的miRNAs表達譜可以提供更多個性化的治療和靶向治療。

3 miRNAs與腎癌預后評估

一些研究表明，miRNAs的異常表達與總生存期、疾病分期、腫瘤轉(zhuǎn)移和復發(fā)的進展相關(guān)。例如，miR-21的表達與腎癌患者的總生存期呈負相關(guān)。miR-21的高表達與miR-199a的低表達一般與腎癌進展期相關(guān)[16,18]。同時，miR-9-1和miR-9-3都在腎細胞癌中表達顯著下調(diào)。其編碼基因的甲基化水平，在轉(zhuǎn)移性腫瘤進展復發(fā)的病例中有較高的表達，并且高表達患者的無復發(fā)生存期少了近30個月[30]。另一個潛在的預后標志物是miR-708，它的靶向基因是Survivin，在腎細胞癌中，這是一個預測腎臟腫瘤進展和患者死亡的獨立預測因子。此外，在轉(zhuǎn)移的病例中，miR-106b表達明顯下調(diào)，是腎臟腫瘤術(shù)后早期轉(zhuǎn)移的預測標志物[22,31]。許多miRNAs可能作為腎癌預后的標志物，一些研究結(jié)果已在體外的腫瘤預測模型中進行了驗證[32,33]，目前仍有必要進行更多的體內(nèi)驗證研究。

4 miRNAs與腎癌治療

在腎細胞癌的發(fā)病機制研究中，發(fā)現(xiàn)了一些miRNAs的靶向因子，這種作用能讓他們成為未來治療的一個有益選擇。不過，個別分子可以通過不同的miRNA靶向，單一的miRNA也可以通過相同的途徑影響多個靶向基因，它可以提供新的治療方案，但也增加了潛在的并發(fā)癥。在腎細胞癌中，miR-224能同時調(diào)控兩個轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-beta，TGFβ)通路，即Smad4和Smad5。另一方面，miR-17-5p和 miR-224的靶向基因均是腫瘤抑制基因VHL和致癌基因HIF-1α[10]，這使得有時候靶向調(diào)控一定程度上失去了特異性。木黃酮類化學染料在體外和體內(nèi)研究中都能降低miR-21的表達。對小鼠腹腔注射該類染料A-498能夠使腎癌腫瘤減小[18]。miR-155可能是一種癌基因，它主要通過抑制堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子1(inhibiting basic leucine zipper transcription factor 1，BACH1)使腎細胞產(chǎn)生異常分裂。因此，針對miR-155使用抗miRNA，可能成為一種新的腎細胞癌治療方法[34]。上調(diào)miR-199靶向調(diào)節(jié)GSK3b，抑制癌細胞生長，因此，調(diào)控miR-199也可能成為一種新的治療方法[16]。另外一項研究結(jié)果顯示，對miR-205的表達進行干擾，能夠抑制原致癌Src家族酪氨酸激酶(Src family tyrosine kinases，SFKs)的表達，從而抑制腎癌細胞的生長[17]。

5 結(jié) 語

miRNAs正在成為腫瘤診斷和分子生物治療的重要一員，盡管目前對miRNAs調(diào)節(jié)通路的了解還不夠，現(xiàn)有的研究結(jié)果顯示，在腎癌腫瘤細胞中miRNAs具有調(diào)控作用，它們是腫瘤診斷、預后及治療反應方面的一種有用的標記物。在已發(fā)表的miRNAs文獻中應用的分析技術(shù)和方法不同，使得到數(shù)據(jù)的可比性受到了限制。為了將實驗室的發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化成臨床應用的成果，必須考慮方法學方面的問題，包括組織保存、準備工作、分析方法的敏感性和特異性、各種方法穩(wěn)定性方面的差異。另外，臨床數(shù)據(jù)的有效性，需要通過多中心的更多樣本研究證實。研究表明，在外周循環(huán)血檢測到的miRNAs的表達具有腫瘤特異性。測量組織、血液、尿液樣本中的miRNAs表達量，進行綜合分析，并將它們作為生物標記物應用于臨床診斷、預后評估及藥物療效等方面的研究中。同時，miRNAs在臨床應用中的可靠性與傳統(tǒng)的臨床、病理和生化結(jié)果相比也更具優(yōu)勢。

原癌基因的控制或腫瘤抑制因子miRNAs能夠協(xié)助調(diào)控腫瘤早期及進展期的發(fā)展。實驗結(jié)果顯示了miRNAs調(diào)控主要的路徑，因此，有可能找到新的治療靶點。然而，基于miRNAs治療策略的研究仍處于初期，潛在治療靶點的識別仍然是認識miRNAs功能的巨大挑戰(zhàn)。在有效的腫瘤細胞轉(zhuǎn)運系統(tǒng)中，治療性的miRNAs以及非選擇性的miRNAs的作用，可能帶來潛在的副作用，阻礙其臨床應用。盡管如此，目前的研究結(jié)論仍然揭示了miRNAs在腎癌診治方面的潛能。因此，研究miRNAs對腫瘤細胞的調(diào)控，是未來腫瘤研究的發(fā)展方向。

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